Ključna razlika – kloniranje naspram subkloniranja
Kloniranje i subkloniranje su molekularne biološke procedure koje stvaraju genetski identične ćelije ili organizme koji nose DNK ili gen koji su od interesa. Kloniranje je tehnika koja uključuje umetanje zainteresovanog gena ili DNK u vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju ćelija ili organizama koji su točne kopije genetskog sastava. Subkloniranje je tehnika koja uključuje umetanje gena od interesa, koji je već umetnut u vektor, u sekundarni vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju genetski identičnih kopija ćelija ili organizama. Ključna razlika između kloniranja i subkloniranja je u tome što, u kloniranju, gen od interesa, kada se jednom veže u vektor, nastavlja proces kloniranja dok se, u subkloniranju, već klonirani gen od interesa odvaja od roditeljskog vektora i ponovo ubacuje u vektor primaoca i nastavite proces.
Šta je kloniranje?
Kloniranje je postupak kojim se proizvode genetski identični organizmi ili ćelije. U prirodi se kloniranje događa putem aseksualne reprodukcije. Kada nema genetske rekombinacije ili promjene, ćelije kćeri dobijaju isti genetski sastav kao roditelj. Prokariotski i eukariotski organizmi stvaraju klonove binarnom fisijom, pupanjem, mitozom, itd. U molekularnoj biologiji, kloniranje gena ili specifičnih fragmenata DNK je popularna metoda za proučavanje strukture i funkcije tog određenog dijela DNK.
Glavni cilj molekularnog kloniranja je napraviti milione kopija genetski identičnih ćelija ili organizama koji nose DNK fragment od interesa (uglavnom geni). Stvara organizme sa tačnim genetskim kopijama drugog. Prvenstveno, specifični geni se kloniraju u molekularnim studijama kako bi se dobile strukturne i funkcionalne informacije i za sekvenciranje DNK. Također, za proizvodnju specifičnih proteina ili proizvoda u velikim količinama, kloniranje se široko koristi.
Procedura kloniranja
Osnovni koraci postupka kloniranja su sljedeći.
- Identifikacija i izolacija gena od interesa. (Amplifikacija gena od interesa PCR-om).
- Restrikciona probava gena od interesa (restrikciona endonukleaza preseca gen).
- Restrikciona probava vektorske DNK. (Vektorska DNK se također seče korištenjem iste restrikcijske endonukleaze).
- Ubacivanje gena u vektor i formiranje rekombinantnog molekula.
- Transformacija rekombinantnog vektora u bakteriju domaćina.
- Izolacija i identifikacija transformiranih bakterija (plazmidni vektor bi trebao sadržavati selektabilni gen, najčešće gen otpornosti na antibiotike za skrining transformiranih bakterija).
- Rekombinantna genska ekspresija unutar domaćina.
Slika_01: Procedura kloniranja
Šta je subkloniranje?
Subkloniranje je postupak premeštanja gena od interesa iz jednog vektora u drugi vektor kako bi se videla ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. U ovoj metodi su uključena dva vektora; naime roditeljski vektor i odredišni vektor. Klonirani umetci se ponovo premeštaju u drugi vektor u subkloniranju. Cilj prenošenja gena iz prvog vektora u drugi vektor je da se dobije nešto što prvi vektor ne bi mogao ili da se ponovo odvoji gen unutar već kloniranog fragmenta DNK i da se ekspresira sam. U ovoj proceduri na početku se koriste restrikcijski enzimi.
Procedura subkloniranja
Osnovni koraci subkloniranja su sljedeći.
- Uz pomoć restrikcijskih endonukleaza, odvajanje DNK od interesa u donorski plazmid (roditeljski vektor).
- Amplifikacija DNK od interesa pomoću PCR-a.
- Pročišćavanje PCR proizvoda (DNK od interesa) gel elektroforezom.
- Otvaranje plazmida primaoca istim restrikcijskim endonukleazama koje se koriste za odvajanje DNK od interesa u roditeljskom plazmidu.
- Ligacija DNK od interesa (gena) u plazmid primaoca da bi se stvorio subklonirani plazmid.
- Transformacija subkloniranog vektora u kompetentnu bakteriju domaćina.
- Provjera transformiranih ćelija.
- Pročišćavanje plazmidne DNK i upotreba za sekvenciranje DNK ili ekspresiju gena za dobijanje željenih proizvoda.
Subkloniranje se sprovodi u slučajevima izolovanja jednog gena iz klonirane grupe gena ili kada se gen od interesa zahteva da se prenese u koristan plazmid da bi se videla tačna funkcija gena od interesa.
Slika_02: Procedura subkloniranja
Koja je razlika između kloniranja i subkloniranja?
Kloniranje vs subkloniranje |
|
| Kloniranje je postupak kojim se proizvode genetski identični organizmi ili ćelije. | Subkloniranje je postupak premeštanja gena od interesa iz jednog vektora u drugi vektor da bi se videla ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. |
| Proces | |
| Odvojite DNK od interesa iz organizma i jednom ubacite u vektor i klonirajte | Već klonirana DNK je odvojena od prvog vektora i umetnuta u drugi vektor i klonirana. |
| Umetanje kretanja putem vektora | |
| Ne pomera umetke (DNK od interesa) iz jednog vektora u drugi vektor. | Premjesti umetke iz roditeljskog vektora u odredišni vektor. |
Sažetak – kloniranje vs subkloniranje
Kloniranje stvara genetski identične ćelije ili organizme sa umetnutim genom ili DNK od interesa. Nastavlja se kroz odvajanje i umetanje DNK od interesa u vektor i ekspresiju unutar bakterije domaćina. Subkloniranje dijeli slične korake sa kloniranjem. Međutim, u subkloniranju, već klonirani fragment DNK (gen od interesa) se ubacuje u vektor i transformiše u bakteriju domaćina. To je ključna razlika između kloniranja i subkloniranja.
