Ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice leži u njihovom načinu ponašanja. Metoda sekvenciranja klon po klon uključuje mapiranje hromozoma i kloniranje prije sekvenciranja, dok sekvenciranje klonom sačmarom izostavlja i mapiranje hromozoma i korake kloniranja tokom sekvenciranja.
Sekvenciranje klonom po klonu i sekvenciranje klonom sačmarom dvije su metode modernog sekvenciranja genoma. Sekvenciranje klon po klon je pouzdaniji metod sekvenciranja. Međutim, metoda kloniranja sekvencioniranjem sačmarica je brža i jeftinija. Članak se fokusira na suptilnu razliku između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice.
Šta je Clone by Clone Sequencing?
Sekvenciranje klon po klon je metoda sekvenciranja genoma. To zahtijeva mapiranje svakog hromozoma prije cijepanja DNK. Nakon mapiranja, DNK treba razbiti na fragmente od 150 kilobaza. Ovi fragmenti su tada spremni za sekvenciranje. Sljedeći korak je umetanje fragmenata DNK u bakterijske umjetne hromozome (BAC), a zatim u bakterijske ćelije. Budući da su fragmenti sada unutar bakterijskih ćelija, svaki put kada se bakterije podijele, umetnuti fragmenti DNK se također dijele i proizvode mnogo identičnih kopija. Zatim se DNK pojedinačnog bakterijskog klona fragmentira na fragmente od 500 parova baza. Oni su manji i fragmenti koji se preklapaju. Zatim, sekvenciranje se odvija umetanjem ovih fragmenata u vektor sa poznatom sekvencom DNK. Počevši od poznatog niza vektora, sekvenciranje se nastavlja do nepoznatog niza.
Nakon završetka sekvenciranja, potrebno je identificirati područja preklapanja sekvenci. Nakon toga, dolazi do spajanja fragmenata kako bi se formirali veći fragmenti koji su prvobitno predstavljeni u BAC-ovima. Zatim, sklapanje većih fragmenata u hromozom se odvija prema mapi genoma.
Slika 01: Kloniranje sekvenciranjem klonova
Značajna prednost sekvenciranja kloniranja klonom je ta što unaprijed pripremljena mapa genoma pomaže pouzdanom sklapanju većih fragmenata. Ali, nedostatak ove metode sekvenciranja je taj što je potrebno mnogo vremena za generiranje mapa genoma i pravljenje klonova. Međutim, ovo je bila metoda preferirana tokom 'Projekta ljudskog genoma'.
Šta je Clone by Shotgun Sequencing?
Clone by shotgun sekvencioniranje je metoda sekvenciranja koja nasumično razbija sekvence DNK na mnogo malih fragmenata i ponovo sastavlja sekvencu posmatranjem preklapajućih regiona. Genome većih sisara je teško klonirati i sastaviti. To je zbog njihove strukturne složenosti i veličine. Iako je metoda sekvenciranja klon po klon pouzdana, potrebno je mnogo vremena za sekvenciranje genoma složenih organizama. Stoga je sekvenciranje kloniranjem sačmom postalo pouzdana jeftinija metoda sekvenciranja koja se može izvesti brže. Stoga se savremeni naučnici oslanjaju na ovu metodu sekvenciranja kako bi se uhvatili u koštac sa složenim genomima.
Slika 02: Clone by Shotgun Sequencing
Tokom kloniranja metodom sekvencioniranja sačmom, nema uobičajenih koraka mapiranja genoma i kloniranja. U početku je cijeli genom fragmentiran u različite veličine od 20 kilobaza do 300 kilobaza. Zatim se odvija sekvenciranje. Zatim, koristeći sofisticirani kompjuterski softver, potrebno je sastaviti fragmente gledajući regije koje se preklapaju.
Clone by shotgun sekvencioniranje pomaže da se poboljša tačnost postojećih sekvenci genoma. Glavna prednost ove metode je da je mnogo brža i jeftinija od metode sekvenciranja klon po klon. Međutim, ovaj proces ne uključuje korištenje genetske mape. Stoga je veća vjerovatnoća da će doći do grešaka tokom sklapanja. Dakle, ovo je veliki nedostatak kod kloniranja metodom sekvenciranja sačmarica.
Koje su sličnosti između kloniranja pomoću sekvenciranja klonom i sekvenciranja sačmarica?
- Sekvencioniranje klon po klon i sekvenciranje sačmarice su dvije metode sekvenciranja genoma.
- Tokom obje tehnike sekvenciranja, sklapanje razbijenih fragmenata se odvija identifikacijom preklapajućih regija.
- Takođe, razbijanje DNK na manje fragmente je neophodno i za sekvenciranje klonova i za sačmaricu.
Koja je razlika između kloniranja pomoću sekvenciranja klonova i sekvenciranja sačmarica?
Tehnika sekvenciranja klona klonom uključuje dva glavna koraka: mapiranje hromozoma i kloniranje. Nasuprot tome, sekvenciranje kloniranja sačmarom ne prati ova dva koraka; nasumično razbija sekvence DNK na mnogo malih fragmenata i ponovo sastavlja sekvencu posmatranjem preklapajućih regiona. Dakle, ovo je ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice. Zbog ovog faktora, sekvenciranje klon po klon je skup i dugotrajan proces, dok je sekvenciranje klon po sačmaricu brže i jeftinije.
Međutim, manja je vjerovatnoća da će se greške tokom sastavljanja pojaviti tokom sekvenciranja kloniranja. Zbog toga ima visoku pouzdanost. Međutim, sekvenciranje kloniranjem sačmarom je relativno manje pouzdana tehnika. Dakle, ovo je takođe značajna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice.
Sljedeća info-grafika predstavlja više informacija o razlici između sekvenciranja klona po klonu i sekvenciranja sačmarice.
Sažetak – Kloniranje po sekvenciranju klonova vs sekvenciranje sačmarica
U sumiranju razlike između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarom, sekvenciranje klon po klonu i sekvenciranje sačmom su dvije metode sekvenciranja genoma. Međutim, tehnika sekvenciranja klon po klon uključuje i mapiranje genoma i procese kloniranja, dok sekvenciranje klon po klonu ne uključuje. Dakle, ovo je ključna razlika između sekvenciranja klon po klon i sekvenciranja sačmarice. Pošto se mapiranje genoma odvija tokom sekvenciranja klona po klonu, manja je vjerovatnoća da će se greške pojaviti tokom sastavljanja sekvenci. Ali, sekvenciranje kloniranjem sačmarom je mnogo brži i jeftiniji proces. Ipak, relativno je manje pouzdan. Sekvenciranje klon po klon bila je poželjna metoda sekvenciranja tokom 'Projekta ljudskog genoma'. Ali, moderni molekularni biolozi se više oslanjaju na sekvenciranje kloniranja pomoću sačmarice.
