Ključna razlika – kloniranje gena u odnosu na PCR
Sinteza mnogih kopija DNK iz specifičnog DNK fragmenta naziva se DNK amplifikacija. Postoje dva glavna procesa amplifikacije DNK, naime kloniranje gena i PCR. Ključna razlika između kloniranja gena i PCR-a je u tome što kloniranje gena proizvodi više kopija specifičnog gena in vivo konstruiranjem rekombinantne DNK i rastom unutar bakterije domaćina, dok PCR proizvodi milione kopija specifičnog DNK fragmenta in vitro koji prolazi kroz ponovljene cikluse denaturacija i sinteza.
Šta je kloniranje gena?
Kloniranje gena je tehnika koja se koristi za lociranje i umnožavanje specifičnog gena iz ekstrahirane genomske DNK organizma kroz izgradnju rekombinantne DNK. Genomska DNK sadrži hiljade različitih gena kodiranih za proteine. Kada se DNK ekstrahuje, uključuje sve moguće gene koje može da podnese. Tehnika kloniranja gena omogućila je detekciju specifičnog gena iz ukupne DNK. Stoga kloniranje gena služi kao važan alat u molekularnoj biologiji.
Izrada genomske biblioteke organizma je neophodna u kloniranju gena ako nema pojma o lokaciji relevantnog gena u DNK. Genomska biblioteka se pravi korišćenjem sledećih koraka.
Korak 1: Ekstrakcija ukupne DNK iz organizma koji sadrži željeni gen.
Korak 2: Restrikcijska probava ekstrahirane DNK za proizvodnju malih fragmenata kojima se može upravljati. Ovaj korak je olakšan restrikcijskim endonukleazama.
Korak 3: Odabir odgovarajućeg vektora i otvaranje vektorske DNK korištenjem istih restrikcijskih endonukleaza. Bakterijski plazmidi se obično koriste kao vektori za nošenje stranog DNK. Plazmidi su mali krugovi DNK koji se nalaze unutar bakterija.
Korak 4: Kombinacija vektorske DNK i fragmentirane DNK za proizvodnju rekombinantne DNK molekule. Ovim korakom upravlja DNK ligaza.
Korak 5: Prenošenje rekombinantnih DNK molekula u bakteriju domaćina. Ovaj korak je poznat kao transformacija i radi se pomoću toplotnog šoka.
Korak 5: Skrining transformiranih bakterijskih ćelija na mediju kulture. Mešovita populacija transformisanih i netransformisanih ćelija domaćina dobija se na kraju procesa transformacije. Kako gen od interesa uključuje samo transformirane ćelije domaćina. Stoga je potrebno odabrati transformirane ćelije. Selekcija se vrši selektivnim podlogama koje sadrže antibiotike. Samo transformisane ćelije rastu na ovom medijumu za skrining omogućavajući selekciju.
Korak 6: Uzgoj bakterija za proizvodnju biblioteke gena. U ovom koraku, transformisane ćelije domaćini se unose u svežu podlogu za kulturu koja obezbeđuje optimalne zahteve za rast. Ukupne kolonije na pločama kulture predstavljaju genomsku biblioteku tog organizma.
Korak 7: Molekul rekombinantne DNK koji sadrži gen od interesa mora biti pregledan od hiljada kloniranih fragmenata rekombinantne DNK. To se može postići upotrebom sondi koje označavaju specifični gen ili specifični protein koji je rezultat tog gena.
Kada se iz ukupnih kolonija identifikuje zainteresovani gen koji sadrži bakterijsku koloniju, moguće je napraviti milione kopija rekombinantnog plazmida koji sadrži gen.
Kloniranje gena se koristi za uspostavljanje biblioteka gena, proizvodnju specijalnih proteina, vitamina, antibiotika, hormona, sekvenciranje i mapiranje genoma organizama, pravljenje višestrukih kopija DNK pojedinaca u forenzici itd.
Slika_1: Kloniranje gena
Šta je PCR?
Lančana reakcija polimeraze (PCR) je tehnika koja generiše veliki broj kopija određenog DNK fragmenta. Eksponencijalna amplifikacija specifične DNK sekvence se dobija PCR-om u in vitro uslovima. Ova tehnika je vrlo moćan alat u molekularnoj biologiji jer može umnožiti mali uzorak DNK u upotrebljivu količinu. PCR je uveo Kary Mullis 1983. godine i ovaj nagrađivani izum stvorio je ogroman napredak u molekularnoj biologiji.
PCR tehnika prati ponovljene PCR reakcije kao što je prikazano na slici 02. Jedna PCR reakcija se sastoji od tri glavna koraka koji se odvijaju na tri različite temperature; denaturacija dvolančane DNK na 94 0C, žarenje prajmera na 68 0C i elongacija lanca na 72 0 C. Stoga, kada se izvodi PCR, temperaturne fluktuacije treba da se održavaju u velikoj mjeri za pravilnu replikaciju. PCR se izvodi u PCR mašini unutar PCR epruveta. PCR epruvete su napunjene ispravnim PCR mješavinama koje sadrže šablonsku DNK, Taq polimerazu, prajmere, dNTP i pufer. Denaturacija dvolančane DNK uzorka u jednolančanu DNK se vrši razbijanjem vodoničnih veza između komplementarnih baza na 94 – 98 0C. Zatim se pojedinačni lanci DNK šablona izlažu prajmerima. Treba obezbediti par prajmera (napred i nazad), koji bi trebalo da budu termostabilni da podnose visoke temperature. Prajmeri su jednolančane kratke DNK sekvence komplementarne krajevima ciljnog DNK fragmenta. U PCR se koriste sintetički prajmeri. Prajmeri se vezuju za komplementarne baze uzorka DNK i pokreću sintezu novog lanca. Ovaj korak je kataliziran enzimom zvanim Taq polimeraza; termostabilni enzim DNK polimeraze izolovan iz Thermus auqaticus. Kada su prajmeri i nukleotidi (građevinski blokovi) dostupni, Taq polimeraza konstruiše novi lanac DNK komplementaran šablonskoj DNK. Na kraju PCR programa, amplificirani fragment DNK se posmatra pomoću gel elektroforeze. Ako je potrebna dalja analiza, PCR proizvod se prečišćava iz gela.
PCR je veoma koristan za dijagnostiku i praćenje genetskih i stečenih bolesti, identifikaciju kriminalaca (u oblasti forenzike), proučavanje strukture i funkcije ciljanog segmenta DNK, sekvenciranje i mapiranje genoma organizama, itd. PCR je postao rutinska laboratorijska tehnika u istraživačkim laboratorijama medicinske i molekularne biologije među naučnicima jer ima širok spektar primjena.
Slika_2: lančana reakcija polimerazom
Koja je razlika između kloniranja gena i PCR-a?
Kloniranje gena vs PCR |
|
| Kloniranje gena je proces pravljenja višestrukih kopija specifičnog gena in vivo putem rekombinantne DNK i transformacije u bakteriju domaćina. | PCR tehnika proizvodi više kopija određene DNK sekvence in vitro kroz ponovljene cikluse PCR reakcija. |
| Zahtjev za izgradnju rekombinantne DNK | |
| Rekombinantna DNK se proizvodi kako bi se locirao gen. | Rekombinantna DNK se ne proizvodi. |
| Potreba za radom | |
| Ovaj proces je radno intenzivan. | Intenzivan rad nije potreban. |
| In vivo ili in vitro proces | |
| Izgradnja rekombinantne DNK je in vitro, a amplifikacija DNK je in vivo. | Umnožavanje DNK se dešava potpuno in vitro. |
Sažetak – Kloniranje gena vs PCR
Kloniranje gena i PCR su dvije metode koje se koriste za amplifikaciju DNK. PCR je in vitro proces koji pravi višestruke kopije DNK određenog fragmenta DNK bez korištenja rekombinantne DNK i organizma domaćina. Kloniranje gena je prvenstveno in vivo proces koji rezultira višestrukim kopijama zainteresovanog gena unutar organizma domaćina putem izgradnje rekombinantne DNK. Ovo je razlika između kloniranja gena i PCR-a.
