Ključna razlika – Sanger sekvenciranje vs Pyrosequencing
DNK sekvenciranje je veoma važno za analizu DNK jer poznavanje ispravnog rasporeda nukleotida na određenoj DNK regiji otkriva mnoge važne informacije o tome. Postoje različite metode sekvenciranja DNK. Sanger sekvenciranje i pirosekvencija su dvije različite metode sekvenciranja DNK koje se široko koriste u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između Sanger sekvenciranja i pirosekvencije je u tome što Sanger sekvenciranje koristi dideoksinukleotide kako bi prekinulo sintezu DNK za čitanje nukleotidne sekvence, dok pirosekvencija otkriva oslobađanje pirofosfata ugrađivanjem nukleotida i sintetizirajući precizan komplementarni red sekvence za čitanje sekvence.
Šta je Sanger sekvenciranje?
Sanger sekvenciranje je prva generacija metode sekvenciranja DNK koju su razvili Frederick Sanger i njegovi koledži 1977. Također je poznato kao sekvenciranje završetka lanca ili dideoksi sekvenciranje jer se zasniva na prekidu lanca dideoksinukleotidima (ddNTP). Ova metoda je bila široko korištena više od 30 godina sve dok nije razvijena sekvenca nove generacije (NGS). Sangerova tehnika sekvenciranja omogućila je otkrivanje ispravnog reda nukleotida ili pričvršćivanje određenog DNK fragmenta. Zasnovan je na selektivnoj inkorporaciji ddNTP i prekidu sinteze DNK tokom in vitro replikacije DNK. Odsustvo 3’ OH grupa za nastavak formiranja fosfodiestarske veze između susjednih nukleotida je jedinstvena karakteristika ddNTP. Dakle, kada je ddNTP vezan, izduženje lanca prestaje i završava se od te tačke. Postoje četiri ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP – koji se koriste u Sangerovom sekvenciranju. Ovi nukleotidi zaustavljaju proces replikacije DNK kada se ugrade u rastući lanac DNK i rezultiraju različitim dužinama kratke DNK. Kapilarna gel elektroforeza se koristi za organiziranje ovih kratkih lanaca DNK prema njihovim veličinama na gelu kao što je prikazano na slici 01.
Slika 1: Kapilarna gel elektroforeza sintetizirane kratke DNK
Za in vitro replikaciju DNK potrebno je osigurati nekoliko zahtjeva. To su enzim DNK polimeraza, DNK šablona, oligonukleotidni prajmeri i deoksinukleotidi (dNTP). U Sanger sekvenciranju, replikacija DNK se izvodi u četiri odvojene epruvete zajedno sa četiri tipa ddNTP odvojeno. Deoksinukleotidi nisu u potpunosti zamijenjeni odgovarajućim ddNTP. Mješavina određenog dNTP (na primjer; dATP + ddATP) je uključena u epruvetu i replicirana. Četiri odvojena proizvoda u epruveti se izvode na gelu u četiri odvojene jažice. Zatim čitanjem gela, sekvenca se može konstruisati kao što je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sanger sekvenciranje
Sanger sekvenciranje je važna tehnika koja pomaže u mnogim područjima molekularne biologije. Projekat ljudskog genoma uspješno je završen uz pomoć metoda baziranih na Sanger sekvenciranju. Sanger sekvenciranje je također korisno u sekvenciranju ciljne DNK, istraživanju raka i genetskih bolesti, analizi ekspresije gena, identifikaciji ljudi, otkrivanju patogena, mikrobnom sekvenciranju itd.
Postoji nekoliko nedostataka Sangerovog sekvenciranja:
- Dužina DNK koja se sekvencira ne može biti duža od 1000 parova baza
- Samo jedan pramen se može sekvencirati u isto vrijeme.
- Proces je dugotrajan i skup.
Stoga, s vremenom su razvijene nove napredne tehnike sekvenciranja kako bi se prevladali ovi problemi. Međutim, Sanger sekvenciranje je još uvijek u upotrebi zbog svojih vrlo preciznih rezultata do otprilike 850 fragmenata dužine baznog para.
Šta je pirosekvencija?
Pyrosequencing je nova tehnika sekvenciranja DNK zasnovana na "sekvenciranju sintezom". Ova tehnika se oslanja na detekciju oslobađanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. Proces koriste četiri različita enzima: DNK polimerza, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza i dva supstrata adenozin 5’ fosfosulfat (APS) i luciferin.
Proces počinje vezivanjem prajmera sa jednolančanim DNK šablonom i DNK polimeraza započinje inkorporaciju nukleotida koji su mu komplementarni. Kada se nukleotidi spoje zajedno (polimerizacija nukleinske kiseline), oslobađa se pirofosfatne (dvije fosfatne grupe povezane zajedno) grupe i energija. Svaki dodatak nukleotida oslobađa ekvimolarnu količinu pirofosfata. Pirofosfat se pretvara u ATP pomoću ATP sulfurilaze u prisustvu supstrata APS. Generisani ATP pokreće konverziju luciferina u oksiluciferin posredovanu luciferazom, proizvodeći vidljivo svjetlo u količinama koje su proporcionalne količini ATP-a. Svjetlost se detektuje pomoću uređaja za detekciju fotona ili fotomultiplikatora i stvara pirogram. Apiraza razgrađuje ATP i neinkorporirane dNTP u reakcionoj smjesi. Dodavanje dNTP se vrši jednom po jednom. Budući da je dodavanje nukleotida poznato prema inkorporaciji i detekciji svjetlosti, može se odrediti sekvenca šablona. Pirogram se koristi za generiranje nukleotidne sekvence uzorka DNK kao što je prikazano na slici 03.
Pirosekvencija je veoma važna u analizi polimorfizma jednog nukleotida i sekvenciranju kratkih delova DNK. Visoka preciznost, fleksibilnost, lakoća automatizacije i paralelna obrada su prednosti pirosekvenciranja u odnosu na Sangerove tehnike sekvenciranja.
Slika 03: Pirosekvencija
Koja je razlika između Sanger sekvenciranja i pirosekvencije?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger sekvenciranje je metoda sekvenciranja DNK zasnovana na selektivnoj inkorporaciji ddNTP-a pomoću DNK polimeraze i prekida lanca. | Pirosekvencija je metoda sekvenciranja DNK zasnovana na detekciji oslobađanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. |
| Upotreba ddNTP | |
| ddNTP-ovi se koriste za prekid replikacije DNK | ddNTP se ne koriste. |
| Uključeni enzimi | |
| Koristi se DNK polimeraza. | Koriste se četiri enzima: DNK polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza i Apiraza. |
| Korišćene podloge | |
| APS i Luciferin se ne koriste. | Koriste se adenozin 5’ fosfosulfat (APS) i luciferin. |
| Maksimalna temperatura | |
| Ovo je spor proces. | Ovo je brz proces. |
Sažetak – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sekvenciranje i pirosekvencija su dvije metode sekvenciranja DNK koje se koriste u molekularnoj biologiji. Sengerovo sekvenciranje konstruiše redosled nukleotida u sekvenci prekidajući elongaciju lanca, dok pirosekvencionisanje konstruiše precizan redosled nukleotida u sekvenci ugradnjom nukleotida i otkrivanjem oslobađanja pirofosfata. Stoga je glavna razlika između Sangerove sekvence i pirosekvencije ta što Sanger sekvenciranje radi na sekvenciranju prekidom lanca, dok pirosekvencija radi na sekvenciranju sintezom.
