Ključna razlika – NGS vs Sanger sekvenciranje
Next Generation Sequencing (NGS) i Sanger Sequencing su dvije vrste tehnika sekvenciranja nukleotida koje su se razvile tokom vremena. Sangerova metoda sekvenciranja bila je naširoko korištena dugi niz godina, a NGS ju je nedavno zamijenio zbog njenih prednosti. Ključna razlika između NGS-a i Sangerovog sekvenciranja je u tome što NGS radi na principu sekvenciranja miliona sekvenci istovremeno na brz način kroz sistem sekvenciranja, dok Sanger sekvenciranje radi na principu završetka lanca zbog selektivne inkorporacije dideoksinukleotida od strane enzima DNK polimeraze. tokom replikacije DNK i rezultirajućeg razdvajanja fragmenata kapilarnom elektroforezom.
Šta je nukleotidno sekvenciranje?
Genetske informacije pohranjene su u nukleotidnim sekvencama DNK ili RNK organizma. Proces određivanja ispravnog reda nukleotida (koristeći četiri baze) u datom fragmentu (u genu, klasteru gena, hromozomu i kompletnom genomu) poznat je kao sekvenciranje nukleotida. Veoma je važno u genomskim studijama, forenzičkim studijama, virologiji, biološkoj sistematici, medicinskoj dijagnostici, biotehnologiji i u mnogim drugim oblastima analizirati strukturu i funkciju gena. Naučnici su razvili različite vrste metoda sekvenciranja. Među njima, Sanger sekvenciranje koje je razvio Frederick Sanger 1977. bilo je naširoko korišteno i popularizirano tokom dugog vremenskog perioda sve dok ga nije zamijenilo sekvenciranje sljedeće generacije.
Šta je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je termin koji se koristi za označavanje modernih procesa sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja koje su revolucionirale genomske studije i molekularnu biologiju. Te tehnike su Illumina sekvenciranje, Roche 454 sekvenciranje, ionsko protonsko sekvenciranje i SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvenciranje. NGS sistemi su brži i jeftiniji. Četiri glavne metode sekvenciranja DNK se koriste u NGS sistemima i to; pirosekvencija, sekvenciranje sintezom, sekvenciranje ligacijom i sekvenciranje ionskih poluvodiča. Veliki broj lanaca DNK ili RNK (milioni) može se sekvencirati paralelno. Omogućava sekvencioniranje cjelokupnog genoma organizama u kratkom vremenskom periodu, za razliku od Sanger sekvenciranja za koje je potrebno više vremena.
NGS ima mnogo prednosti u odnosu na konvencionalnu Sanger metodu sekvenciranja. To je brz, precizniji i isplativiji proces koji se može izvesti s malom veličinom uzorka. NGS se može koristiti u metagenomskim studijama, u otkrivanju varijacija unutar pojedinačnog genoma zbog umetanja i delecija itd. i u analizi ekspresije gena.
Slika_1: Razvoj u NGS sekvenciranju
Šta je Sanger sekvenciranje?
Sanger Sequencing je metoda sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegove kolege 1977. godine da bi se odredio precizan redoslijed nukleotida datog DNK fragmenta. Takođe je poznato kao sekvenciranje završetka lanca ili sekvenciranje dideoksi. Princip rada ove metode je završetak sinteze lanca selektivnim ugrađivanjem dideoksinukleotida koji završavaju lanac (ddNTP) kao što su ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNK polimeraze tokom replikacije DNK. Normalni nukleotidi imaju 3’ OH grupe za formiranje fosfodiestarske veze između susjednih nukleotida kako bi se nastavilo formiranje lanca. Međutim, ddNTP-ovima nedostaje ova 3’OH grupa i nisu u stanju da formiraju fosfodiestarske veze između nukleotida. Dakle, istezanje lanca je prestalo.
U ovoj metodi, jednolančana DNK koja se sekvencira služi kao šablonski lanac za in vitro sintezu DNK. Ostali zahtjevi su oligonukleotidni prajmer, deoksinukleotidni prekursori i enzim DNK polimeraze. Kada su poznati bočni krajevi ciljnog fragmenta, prajmeri se mogu lako dizajnirati za replikaciju DNK. Četiri odvojene reakcije sinteze DNK izvode se u četiri odvojene cijevi. Svaka cijev ima odvojene ddNTP, zajedno sa drugim zahtjevima. Od određenog nukleotida dodaje se mješavina dNTP i ddNTP. Isto tako, četiri odvojene reakcije se izvode u četiri epruvete sa četiri mješavine. Nakon reakcija, vrši se detekcija fragmenata DNK i pretvaranje uzorka fragmenata u informacije o sekvenci. Nastali fragmenti DNK se termički denaturiraju i odvajaju gel elektroforezom. Ako se koriste radioaktivni nukleotidi, uzorak trake u poliakrilamidnom gelu može se vizualizirati autoradiografijom. Kada ova metoda koristi fluorescentno označene dideoksinukleotide, može se ublažiti očitavanjem gela i proći kroz snop lasera da bi se detektirao fluorescentni detektor. Kako bi se izbjegle greške koje bi mogle nastati kada se sekvenca očita okom i ručno unese u računar, ova metoda se razvila u korištenje automatiziranog sekvencera spojenog sa računarom.
Ovo je metoda koja se koristi za sekvenciranje DNK iz projekta Ljudski genom. Ova metoda se još uvijek koristi s naprednim modifikacijama jer daje tačne informacije o sekvenci uprkos tome što je skup i spor proces.
Slika_2: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između NGS-a i Sanger sekvenciranja?
NGS vs Sanger sekvenciranje |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) odnosi se na moderne procese sekvenciranja visoke propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja | Sanger Sequencing je metoda sekvenciranja koju je razvio Frederick Sanger kako bi se odredio precizan redoslijed nukleotida datog DNK fragmenta. |
| Efektivnost | |
| NGS je jeftiniji proces jer smanjuje vrijeme, snagu ljudi i hemikalije. | Ovo je skup proces jer je potrebno vrijeme, ljudska snaga i više hemikalija. |
| Speed | |
| Ovo je brže jer se i hemijska detekcija i detekcija signala mnogih niti odvijaju paralelno. | Ovo je dugotrajno jer se hemijska detekcija i detekcija signala dešavaju kao dva odvojena procesa i samo na niti može čitati istovremeno. |
| Pouzdanost | |
| NGS je pouzdan. | Sanger sekvenciranje je manje pouzdano |
| Veličina uzorka | |
| NGS zahtijeva manje količine DNK. | Ova metoda zahtijeva veliku količinu DNK šablona. |
| DNK baze po sekvenciranom fragmentu | |
| Broj DNK baza po sekvenciranom fragmentu je manji od Sangerove metode | Generisanje sekvenci je duže od NGS sekvence. |
Sažetak – NGS vs Sanger sekvenciranje
NGS i Sangerovo sekvenciranje su tehnike sekvenciranja nukleotida koje se intenzivno koriste u molekularnoj biologiji. Sanger sekvenciranje je rana metoda sekvenciranja koja je zamijenjena NGS-om. Glavna razlika između NGS i Sanger sekvenciranja je u tome što je NGS brz, precizniji i isplativiji proces od Sanger sekvenciranja. Obje tehnike su dovele do velikih epidemija u genetici i biotehnologiji.
