Ključna razlika – hodanje po hromozomu vs skakanje
Homozomsko hodanje i skakanje hromozoma su dva tehnička alata koja se koriste u molekularnoj biologiji za lociranje gena na hromozomima i fizičko mapiranje genoma. Hodanje hromozoma je tehnika koja se koristi za kloniranje ciljnog gena u genomskoj biblioteci ponovljenom izolacijom i kloniranjem susjednih klonova genomske biblioteke. Kromosomsko skakanje je posebna verzija kromosomskog hodanja koja prevazilazi granice hromozomskog hodanja. Kromosomsko hodanje može samo sekvencirati i mapirati male dužine hromozoma, dok hromozomsko skakanje omogućava sekvenciranje velikih dijelova hromozoma. Ovo je ključna razlika između kromosomskog hodanja i kromosomskog skakanja.
Šta je hodanje hromozomima?
Chromosome walking je alat koji istražuje nepoznate sekvence hromozomskih regiona korišćenjem preklapajućih restrikcijskih fragmenata. U hodanju po hromozomu, dio poznatog gena se koristi kao sonda i nastavlja s karakterizacijom pune dužine hromozoma koji treba mapirati ili sekvencirati. Ovo ide od markera do ciljne dužine. Kod hodanja po hromozomu, krajevi svakog preklapajućeg fragmenta se koriste za hibridizaciju da bi se identifikovala sledeća sekvenca.
Sonde su pripremljene od krajnjih delova klonirane DNK i one su subklonirane. Zatim se koriste za pronalaženje sljedećeg preklapajućeg fragmenta. Sve ove preklapajuće sekvence se koriste za konstruisanje genetske mape hromozoma i lociranje ciljnih gena. To je metoda analize dugih dijelova DNK pomoću malih preklapajućih fragmenata iz rekonstruirane genomske biblioteke.
Tehnika hodanja po hromozomu – koraci
-
Izolacija fragmenta DNK koji sadrži poznati gen ili marker blizu ciljnog gena
- Priprema mape ograničenja odabranog fragmenta i subkloniranje krajnjeg područja fragmenta za korištenje kao sonda
- Hibridizacija sonde sa sljedećim preklapajućim fragmentom
- Priprema mape restrikcije fragmenta 1 i subkloniranje krajnjeg regiona fragmenta 1 za upotrebu kao sonda za identifikaciju sljedećeg preklapajućeg fragmenta.
- Hibridizacija sonde sa sljedećim preklapajućim fragmentom 2
- Priprema restrikcijske mape fragmenta 2 i subkloniranje krajnjeg regiona fragmenta 2 da služi kao sonda za identifikaciju sljedećeg preklapajućeg fragmenta
Gore korake treba nastaviti do ciljanog gena ili do 3’ kraja ukupne dužine sekvence.
Slika 01: Tehnika hodanja po hromozomu
Homozomsko hodanje je važan aspekt citogenetike u pronalaženju SNP-ova mnogih organizama i analizi genetski prenosivih bolesti i pronalaženju mutacija relevantnih gena.
Šta je skakanje hromozoma?
Hromozomsko skakanje je tehnika koja se koristi u molekularnoj biologiji za fizičko mapiranje genoma organizama. Ova tehnika je uvedena kako bi se prevazišla barijera hromozomskog hodanja koja je nastala nakon pronalaženja repetitivnih regiona DNK tokom procesa kloniranja. Stoga se tehnika skakanja hromozoma može smatrati posebnom verzijom kromosomskog hodanja. To je brza metoda u poređenju sa hromozomskim hodanjem i omogućava zaobilaženje ponavljajućih sekvenci DNK koje nisu sklone kloniranju tokom hromozomskog hodanja. Kromosomsko skakanje sužava jaz između ciljnog gena i dostupnih poznatih markera za mapiranje genoma.
Alatka za skakanje hromozoma počinje rezanjem specifične DNK sa posebnim restrikcijskim endonukleazama i ligacijom fragmenata u kružne petlje. Zatim se prajmer dizajniran iz poznate sekvence koristi za sekvenciranje kružnih petlji. Ovaj prajmer omogućava skakanje i sekvenciranje na alternativni način. Dakle, može zaobići ponavljajuće sekvence DNK i brzo hodati kroz hromozom u potrazi za ciljnim genom.
Otkriće gena koji kodira bolest cistične fibroze urađeno je pomoću hromozomskog alata za skakanje. U kombinaciji, kromosomsko skakanje i hodanje mogu poboljšati proces mapiranja genoma.
Slika 02: Skakanje hromozoma
Koja je razlika između hodanja po hromozomima i skakanja?
Chromosome hodanje vs skakanje |
|
| Chromosome je alat koji se koristi u molekularnoj biologiji za mapiranje genoma i lociranje specifičnih gena. | Chromosome jumping je alat koji se koristi za fizičko mapiranje genoma i brzo pronalaženje ciljnih gena u hromozomima. |
| Uporedne dužine sekvenciranja | |
| Samo mali fragmenti mogu se klonirati kromosomskim hodanjem. | Veće dužine hromozoma mogu se mapirati kromosomskim skokom. |
| Kloniranje repetitivne DNK u hromozomima | |
| Tehnika hodanja po hromozomima ima poteškoća u hodanju kroz ponavljajuće sekvence DNK pronađene u hromozomima. | Omogućava zaobilaženje ponavljajućih sekvenci DNK. Stoga nema poteškoća kada ih pronađe tokom sekvenciranja. |
| Faktori koji utiču na procese | |
| Uspjeh procesa zavisi od veličine genoma i udaljenosti koja se mora "prepješačiti" od poznate genomske pozicije do željenog gena. | Uspjeh ne zavisi od veličine genoma na udaljenosti od markera do mete. |
| Efekti neklonirane DNK | |
| Hromozomsko hodanje može se zaustaviti nekloniranim fragmentima DNK. | Najniža nota koju piccolos može svirati je D4. |
| Potreba za poznatim redoslijedom | |
| Proces počinje sa poznatim genom u blizini mete. | Proces zahtijeva poznati fragment za dizajn prajmera. |
Sažetak – hodanje po hromozomu vs skakanje
Hromozomsko hodanje se često primjenjuje kada se zna da se određeni gen nalazi u blizini prethodno kloniranog gena u hromozomu i moguće ga je identificirati ponovljenom izolacijom susjednih genomskih klonova iz genomske biblioteke. Međutim, kada se ponavljajuća područja DNK pronađu tokom tehnike kromosomskog hodanja, proces se ne može nastaviti. Dakle, tehnika se prekida od te tačke. Kromosomsko skakanje je molekularno biološko sredstvo koje prevazilazi ovo ograničenje za mapiranje genoma. On zaobilazi ove repetitivne regije DNK koje je teško klonirati i pomaže u fizičkom mapiranju genoma. Ovo je glavna razlika između hodanja po hromozomu i skakanja.
