Ključna razlika – Microarray vs RNA Sequencing
Transkriptom predstavlja cijeli sadržaj RNK prisutan u ćeliji uključujući mRNA, rRNA, tRNA, degradiranu RNK i nerazgrađenu RNK. Profiliranje transkriptoma je važan proces za razumijevanje uvida u ćelije. Postoji nekoliko naprednih metoda za profilisanje transkriptoma. Microarray i RNA sekvenciranje su dvije vrste tehnologija koje su razvijene za analizu transkriptoma. Ključna razlika između mikromreža i RNK sekvenciranja je u tome što se mikroniz zasniva na hibridizacionom potencijalu unapred dizajniranih obeleženih sondi sa ciljnim sekvencama cDNK, dok se sekvenciranje RNK zasniva na direktnom sekvenciranju cDNK lanaca naprednim tehnikama sekvenciranja kao što je NGS. Microarray se izvodi uz prethodno znanje o sekvencama, a sekvenciranje RNA se izvodi bez prethodnog znanja o sekvencama.
Šta je Microarray?
Microarray je robusna, pouzdana i visoka propusna metoda koju naučnici koriste za profiliranje transkriptoma. To je najpopularniji pristup za analizu transkripta. To je jeftina metoda, koja ovisi o hibridizacijskim sondama.
Tehnika počinje ekstrakcijom mRNA iz uzorka i izgradnjom cDNK biblioteke iz ukupne RNK. Zatim se miješa sa fluorescentno označenim unaprijed dizajniranim sondama na čvrstoj površini (spot matrica). Komplementarne sekvence se hibridizuju sa obeleženim sondama u mikronisu. Zatim se mikroniz ispere i pregleda, a slika se kvantificira. Prikupljene podatke treba analizirati kako bi se dobili relativni profili izraza.
Pretpostavlja se da je intenzitet sondi mikromreža proporcionalan količini transkripata u uzorku. Međutim, tačnost tehnike zavisi od dizajniranih sondi, prethodnog poznavanja sekvence i afiniteta sondi za hibridizaciju. Stoga tehnologija mikromreža ima ograničenja. Tehnika mikromreža se ne može izvesti sa transkriptima male količine. Ne uspijeva razlikovati izoforme i identificirati genetske varijante. Pošto ova metoda zavisi od hibridizacije sondi, neki problemi vezani za hibridizaciju kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija itd. se javljaju u tehnici mikromreža.
Slika 01: Microarray
Šta je sekvenciranje RNA?
RNA sekvencioniranje sačmaricama (RNA seq) je nedavno razvijena tehnika sekvenciranja cijelog transkriptoma. To je brza i propusna metoda profiliranja transkriptoma. On direktno kvantificira ekspresiju gena i rezultira dubljim istraživanjem transkriptoma. RNA sekvenca ne zavisi od unapred dizajniranih sondi ili prethodnog znanja o sekvencama. Stoga, RNA seq metoda ima visoku osjetljivost i sposobnost otkrivanja novih gena i genetskih varijanti.
Metoda sekvenciranja RNK se izvodi kroz nekoliko koraka. Ukupna RNK ćelije mora biti izolirana i fragmentirana. Zatim, koristeći reverznu transkriptazu, mora se pripremiti biblioteka cDNK. Svaki cDNK lanac mora biti povezan sa adapterima. Zatim ligirani fragmenti moraju biti amplificirani i pročišćeni. Konačno, koristeći NGS metodu, mora se izvršiti sekvencioniranje cDNK.
Slika 02: RNK sekvenciranje
Koja je razlika između Microarray i RNA sekvenciranja?
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Microarray je robusna, pouzdana metoda visoke propusnosti. | RNA sekvenciranje je precizna i visoko propusna metoda. |
| Cena | |
| Ovo je jeftina metoda. | Ovo je skupa metoda. |
| Analiza velikog broja uzoraka | |
| Ovo olakšava analizu velikog broja uzoraka istovremeno. | Ovo olakšava analizu velikog broja uzoraka. |
| Analiza podataka | |
| Analiza podataka je složena. | Ovom metodom se generiše više podataka; stoga je proces složeniji. |
| Prethodno poznavanje sekvenci | |
| Ova metoda je bazirana na hibridizacijskim sondama, tako da je potrebno prethodno poznavanje sekvenci. | Ova metoda ne zavisi od prethodnog poznavanja sekvence. |
| Strukturne varijacije i novi geni | |
| Ova metoda ne može otkriti strukturne varijacije i nove gene. | Ova metoda može otkriti strukturne varijacije kao što su spajanje gena, alternativno spajanje i novi geni. |
| Osjetljivost | |
| Ovo ne može otkriti razlike u ekspresiji izoforma, tako da ima ograničenu osjetljivost. | Ovo ima visoku osjetljivost. |
| Ishod | |
| Ovo može rezultirati samo relativnim nivoima ekspresije. Ovo ne daje apsolutnu kvantifikaciju ekspresije gena. | Daje apsolutne i relativne nivoe izraza. |
| Reanalysis podataka | |
| Ovo se mora ponoviti da bi se ponovo analiziralo. | Podaci o sekvenciranju se mogu ponovo analizirati. |
| Potreba za određenim osobljem i infrastrukturom | |
| Za mikromrež nije potrebna posebna infrastruktura i osoblje. | Specifična infrastruktura i osoblje potrebni za RNA sekvenciranje. |
| Tehnička pitanja | |
| Microarray tehnika ima tehničke probleme kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa detekcije pojedinačnih sondi, itd. | RNA seq tehnika izbjegava tehničke probleme kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa detekcije pojedinačnih sondi, itd. |
| Pristranosti | |
| Ovo je pristrasna metoda jer zavisi od hibridizacije. | Bias je nizak u poređenju sa mikromrežom. |
Sažetak – Microarray vs RNA Sequencing
Microarray i RNK metode sekvenciranja su platforme visoke propusnosti razvijene za profiliranje transkriptoma. Obje metode daju rezultate koji su u velikoj mjeri povezani sa profilima ekspresije gena. Međutim, sekvenciranje RNK ima prednosti u odnosu na mikromreže za analizu genske ekspresije. RNK sekvenciranje je osjetljivija metoda za detekciju transkripata male količine nego mikromreža. RNK sekvenciranje također omogućava razlikovanje izoforma i identifikaciju varijanti gena. Međutim, mikromrež je uobičajen izbor većine istraživača jer je sekvenciranje RNK nova i skupa tehnika sa izazovima pohranjivanja podataka i složenom analizom podataka.
