Ključna razlika – PCR prajmeri naspram prajmera za sekvenciranje
Sa nedavnim razvojem u oblasti molekularne biologije, razvijene su različite genetske tehnike koje su učinile procese istraživanja različitih puteva subjekta lakim i preciznim. PCR i druge procedure sekvenciranja su dvije važne takve tehnike. Koriste različite podkomponente. Prajmeri se smatraju glavnom podkomponentom zajedničkom i PCR i tehnikama sekvenciranja. PCR prajmeri se koriste za amplifikaciju određene DNK sekvence, dok se prajmeri za sekvenciranje koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog reda nukleotidne sekvence. Ovo je ključna razlika između PCR prajmera i prajmera za sekvenciranje.
Šta su PCR prajmeri?
Polymerase Chain Reaction (PCR) je genetska tehnika koja se koristi u polju molekularne biologije kako bi se pojačala jedna ili nekoliko kopija određenog segmenta DNK i dobilo mnogo miliona identičnih kopija. U PCR reakciji se koriste različite komponente uključujući prajmere. Prajmeri su kratki DNK lanci sa dužinom nukleotida od 18-25 što ih čini kompatibilnim sa početnim i krajnjim regionom DNK fragmenata koji se amplificiraju. Prajmeri mogu biti prednji i reverzni prajmer. Ovi prajmeri se vezuju za fragment DNK na određenim tačkama gde čine DNK polimerazu da se veže za specifični prajmer na lokaciji i iniciraju sintezu novog lanca DNK.
Odabir prajmera je važan aspekt PCR procesa. Odabir dužine prajmera je važan. Idealna dužina bi bila 18-25 nukleotida. Ako je dužina prekratka ili predugačka, prajmeri se neće vezati za sekvencu DNK da bi se precizno amplificirali. Prajmeri koji su prekratki po dužini dovode do nespecifičnog žarenja prajmera na različitim lokacijama DNK sekvence.
Slika 01: PCR prajmeri
Sadržaj gvanina i citozina (GC) u dobrom prajmeru trebao bi biti u rasponu od 40-60. Temperatura žarenja prajmera i temperatura topljenja su vitalni faktori tokom PCR-a. Temperaturu topljenja treba precizno izračunati, a temperatura žarenja prajmera treba da bude 5 0C niža od temperature topljenja. Temperatura topljenja treba da bude 60 °C i 75 °C. Previsoke ili preniske temperature će rezultirati manje aktivnom aktivnošću DNK polimeraze.
Šta su prajmeri za sekvenciranje?
Sekvencioni prajmeri se koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK sa namerom da se otkrije njegov specifični identitet. Za postizanje dobrih rezultata sekvenciranja važni su visokokvalitetni prajmeri i šabloni. Stoga, kada su prajmeri odabrani, oni bi trebali biti jedinstveni za određenu regiju gdje želimo sekvencirati. Također bi trebao biti s pravilnom orijentacijom gdje se sekvence obično stvaraju od 3’ do 5’ krajeva prajmera. Slijedu bi trebala nedostajati nepoželjna samohibridizacija kao što je formiranje ukosnica. Ne bi trebao sadržavati uzastopno formiranje gvaninskih baza.
Temperatura topljenja (Tm) prajmera mora biti prikladna za uslove sekvenciranja. Prema tome, trebalo bi da bude između 52oC i 74oC. Priprema oligonukleotida koji će se koristiti kao prajmer treba pročistiti da bi se dobila željena puna dužina sekvence. Ako oligonukleotidi sadrže nečistoće, signalizacija prajmerske sekvence će biti superponirana sa različitih prajmerskih mjesta, a to će također smanjiti broj baznih ćelija.
Slika 02: Sequencing Primers
Temperatura topljenja prajmera (Tm) oligonukleotida određuje koliko su jaki komplementarni lanci DNK međusobno hibridizovani. Tm se može smatrati termodinamičkim proračunom gdje ovisi o sekvencama DNK i nekoliko uslova kao što je koncentracija soli. Tm je važan tokom PCR-a, gdje se varijanta koja se zove sekvenciranje ciklusa koristi za proizvodnju grupe fragmenata okončanih dideoksinukleotidom. Ovdje će prajmer koji se sekvencira u početku alternativno žariti, zatim produžiti i na kraju denaturirati za amplifikaciju. Stoga bi vrijednost Tm trebala biti između 52oC i 74o C. Sintetizirani oligonukleotidi se mogu dobiti iz laboratorija za sintezu DNK/RNA prema izbor. Mala skala sinteze koja se koristi za sekvenciranje DNK obično je 50 nmol. Takođe, najvažnije, prajmeri koji se koriste za sekvenciranje treba da budu pročišćeni kako bi bili bez nečistoća koje će sprečiti smanjenje kvaliteta.
Koje su sličnosti između PCR prajmera i prajmera za sekvenciranje?
- I PCR prajmeri i prajmeri za sekvenciranje su prajmeri koji se koriste u procesu amplifikacije ciljane DNK sekvence.
- I PCR prajmeri i prajmeri za sekvenciranje se sastoje od nukleotida.
- I PCR prajmeri i prajmeri za sekvenciranje su kratki oligomeri.
Koja je razlika između PCR prajmera i prajmera za sekvenciranje?
PCR Primeri vs Sequencing Primeri |
|
| PCR prajmeri su kratki DNK lanci sa dužinom nukleotidne sekvence od 18-25 što ih čini kompatibilnim sa početnim i krajnjim regionom DNK fragmenata koji treba da se amplificiraju. | Sekvencijski prajmeri su kratki oligomeri koji se koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. |
| Funkcija | |
| PCR prajmeri se koriste za amplifikaciju određene DNK sekvence. | Sekvencirajući prajmeri se koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK s namjerom otkrivanja njegovog specifičnog identiteta. |
| Potreban broj primera | |
| Dva prajmera; jedan prednji prajmer i jedan reverzni prajmer se koriste kao PCR prajmeri. | Potreban je samo jedan prajmer kao prajmer za sekvenciranje. |
Sažetak – PCR prajmeri vs prajmeri za sekvenciranje
Sekvencioni prajmeri se koriste u kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK sa namerom da se otkrije njegov specifični identitet. Jedan prajmer za sekvenciranje će biti dovoljan za pokretanje procesa. Za postizanje dobrih rezultata sekvenciranja važni su visokokvalitetni prajmeri i šabloni. Stoga, kada su prajmeri odabrani, oni bi trebali biti jedinstveni za određenu regiju gdje želimo sekvencirati. PCR prajmeri su kratki DNK lanci sa dužinom nukleotida od 18-25 koji je kompatibilan sa početnim i krajnjim regionom DNK fragmenata koji se amplificiraju. PCR prajmeri mogu biti prednji i reverzni prajmer. Sadržaj gvanina i citozina (GC) u dobrom prajmeru trebao bi biti u rasponu od 40-60. Temperatura žarenja prajmera i temperatura topljenja su vitalni aspekti tokom PCR-a. Ovo je razlika između PCR prajmera i prajmera za sekvenciranje.
