PCR vs PCR u realnom vremenu
PCR ili lančana reakcija polimeraze je revolucionarno otkriće u modernoj molekularnoj biologiji, koje je prvi razvio hemičar Kary Mullis 1983. Omogućava da se jedna sekvenca u kompleksnoj DNK amplificira za analizu. Osnovna ideja PCR-a je da su dva prajmera, koji su komplementarni suprotnim lancima DNK sekvence, orijentisani jedan prema drugom; prajmeri proizvode komplementarne niti, od kojih svaki sadrži drugi prajmer. Dakle, rezultat je velika količina sekvence koja odgovara DNK koja se nalazi između dva prajmera. Enzim DNK polimeraza se koristi za proširenje prajmera u PCR-u. DNK polimeraza je termostabilan enzim i ima sposobnost da preživi na visokim temperaturama (94 do 95 °C) koji se koristi za denaturaciju šablonske DNK.
PCR uključuje tri koraka, naime, ponovljene krugove denaturacije, žarenje prajmera i sintezu DNK. Termocikler mašina se koristi za izvođenje ove reakcije tako da se može programirati da brzo i precizno mijenja temperature. Primjene PCR-a su kriminalističke istrage, DNK otisak prsta, otkrivanje patogena i analiza DNK ranih ljudskih vrsta.
Šta je konvencionalni PCR?
Postoje tri glavne faze konvencionalnog PCR-a, naime; Faza amplifikacije DNK, odvajanje PCR-a i detekcija proizvoda. Odvajanje segmenata DNK se obično vrši elektroforezom u agaroznom gelu. Proizvodi se zatim boje etheiduim bromidom. Konačno, detekcija se postiže vizualizacijom traka na gelovima pod UV svjetlom. Stoga se konačni rezultati konvencionalnog PCR-a ne izražavaju brojevima. Obično konvencionalni PCR može otkriti samo jedan parametar.
Šta je PCR u realnom vremenu?
PCR u realnom vremenu može otkriti amplifikaciju proizvoda, kako se proizvodi sintetiziraju. Sa razvojem tehnologije, PCR je postao vrlo popularna tehnika, posebno za detekciju i identifikaciju bakterija u hrani. PCR u realnom vremenu koristi sistem fluorescentne boje i termocikler opremljen sposobnošću fluorescentne detekcije.
Koja je razlika između konvencionalnog PCR-a i PCR-a u realnom vremenu?
• Konvencionalni PCR oduzima više vremena jer koristi gel elektroforezu za analizu pojačanih PCR proizvoda. Nasuprot tome, PCR u realnom vremenu oduzima manje vremena jer može otkriti amplifikacije tokom ranih faza reakcije.
• PCR u realnom vremenu prikuplja podatke u fazi eksponencijalnog rasta PCR-a, dok tradicionalni PCR prikuplja podatke na krajnjoj točki reakcije.
• Rezultati krajnje tačke konvencionalnog PCR-a možda nisu vrlo precizni, ali rezultati PCR-a u realnom vremenu su vrlo precizni.
• PCR u realnom vremenu je osjetljiviji od konvencionalnog PCR-a.
• Konvencionalni PCR ima vrlo lošu rezoluciju dok PCR u realnom vremenu može otkriti vrlo male promjene zbog visoke rezolucije.
• Detekcija krajnje tačke konvencionalnog PCR-a ima kratak dinamički opseg dok PCR detekcija u realnom vremenu ima širok dinamički opseg.
• Za razliku od konvencionalnog PCR-a, automatske tehnike detekcije se nalaze u PCR-u u realnom vremenu.
• Konvencionalni PCR je visoko sofisticiran i radno intenzivan više od PCR-a u realnom vremenu.
• Za razliku od PCR-a u realnom vremenu, konvencionalni PCR ne može razlikovati mrtve i žive bakterije.
• PCR u realnom vremenu koristi sistem fluorescentnih boja za detekciju proizvoda, dok konvencionalni PCR koristi etidijum bromid i UV svjetlo za vizualizaciju traka u mediju agaroznog gela.
