Ključna razlika između konvencionalnog ugniježđenog i PCR testa u realnom vremenu je u tome što je konvencionalni PCR tehnika razvijena za amplifikaciju specifičnih sekvenci DNK, a ugniježđeni PCR je modifikacija konvencionalnog PCR-a koja se sastoji od dvije sekvencijalne reakcije amplifikacije, dok je stvarna -time PCR je varijanta konvencionalnog PCR-a koji može kvantifikovati amplificirani proizvod.
PCR je vrlo uobičajena naučna tehnika koja se široko koristi u istraživanju i medicini za otkrivanje DNK. PCR testovi se koriste za otkrivanje antigena otkrivanjem njihove DNK ili RNK. Općenito, virusna RNK je prisutna u tijelu prije otkrivanja antitijela ili pokazivanja simptoma bolesti. PCR test može odrediti da li neko ima virus ili ne. Trenutno je PCR standardni test za otkrivanje bolesti COVID-19. Postoje različite vrste PCR tehnika kao što su PCR u realnom vremenu, ugniježđeni PCR, multipleks PCR, vrući start PCR i PCR dugog dometa, itd.
Šta su konvencionalni PCR testovi?
Konvencionalni PCR test je tehnika in vitro amplifikacije DNK koja se rutinski izvodi u molekularno biološkim laboratorijama. Ova metoda je omogućila proizvodnju hiljada do miliona kopija određenog fragmenta DNK. Kary Mullis uveo je ovu tehniku 1980. godine. Ova tehnika zahtijeva fragment DNK poznat kao šablon da bi se napravile mnoge njegove kopije. Taq polimeraza radi kao enzim DNK polimeraze i katalizira sintezu novih lanaca šablonske sekvence.
Primeri u PCR mješavini će raditi kao početne tačke za ekstenzije fragmenata. Svi sastojci koji su potrebni za pravljenje kopija DNK uključeni su u PCR smjesu. PCR reakcija se izvodi u PCR mašini i treba je hraniti ispravnom PCR smešom i ispravnim PCR programom. Ako su reakciona smjesa i program ispravni, proizvest će potreban broj kopija određenog dijela DNK iz vrlo male količine DNK.
Slika 01: Konvencionalni PCR test
Postoje tri glavna koraka uključena u PCR reakciju: denaturacija, žarenje prajmera i produžavanje niti. Ova tri koraka se dešavaju na tri različite temperature. PCR pufer održava optimalne uslove za djelovanje Taq polimeraze. Ove tri faze PCR reakcije se ponavljaju kako bi se proizvela potrebna količina PCR proizvoda. Prilikom svake PCR reakcije, broj kopija DNK se udvostručuje. Stoga se u PCR-u može uočiti eksponencijalna amplifikacija. PCR proizvod se može razlučiti pomoću gel elektroforeze jer proizvodi vidljivu količinu DNK na gelu i može se pročistiti za daljnje studije kao što je sekvenciranje.
PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. Posebno u forenzičkim studijama, PCR ima ogromnu vrijednost jer može pojačati DNK za studije iz sićušnih uzoraka kriminalaca i napraviti forenzičke DNK profile. PCR se široko koristi u mnogim područjima molekularne biologije, uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, detekciju mutacija, sekvenciranje DNK, DNK mikromreže i testiranje očinstva.
Šta su ugniježđeni PCR testovi?
Ugniježđeni PCR je tip PCR-a koji smanjuje nespecifičnu amplfikaciju DNK. Postoje dva uzastopna PCR-a ili dvije sekvencijalne reakcije amplifikacije u ugniježđenom PCR testu. Tokom prve reakcije amplifikacije, proizvodi se PCR proizvod. Nakon prve reakcije, druga reakcija amplifikacije se izvodi na PCR proizvodu prve reakcije. Stoga se prajmeri u drugoj reakcijskoj smjesi vezuju za prvi PCR proizvod i pojačavaju ga.
Slika 02: Nested PCR
Primer parovi su različiti u svakoj reakciji. Nespecifično vezivanje prajmera je smanjeno u ugnježđenom PCR-u. Ugniježđeni PCR testovi su korisni za povećanje osjetljivosti i/ili specifičnosti. Međutim, ugniježđeni PCR zahtijeva znanje o zainteresiranoj sekvenci.
Šta su PCR testovi u realnom vremenu?
PCR u realnom vremenu ili kvantitativni PCR (Q PCR) je modificirana verzija PCR-a koja kvantitativno mjeri PCR proizvode. Stoga, ova tehnika kvantifikuje pojačanje u realnom vremenu koristeći PCR mašinu u realnom vremenu. To je također pogodna metoda za određivanje količine ciljne sekvence ili gena prisutnog u uzorku.
Zanimljiva karakteristika PCR-a u realnom vremenu je da kombinuje i amplifikaciju i pravu kvantifikaciju u jednom koraku. Stoga, potreba za gel elektroforezom za detekciju može biti eliminirana PCR tehnikom u realnom vremenu. Upotreba fluorescentnih boja za označavanje PCR proizvoda tokom PCR reakcija će na kraju dovesti do direktne kvantifikacije. Kada se PCR proizvodi akumuliraju, akumuliraju se i fluorescentni signali, koji će biti izmjereni mašinom u realnom vremenu. SYBR Green i Taqman su dvije metode za otkrivanje ili praćenje procesa amplifikacije PCR-a u realnom vremenu. Obje metode prate napredak procesa pojačanja i izvještavaju o količini proizvoda u realnom vremenu.
Slika 03: PCR u realnom vremenu
PCR u realnom vremenu ima široku paletu primjena kao što su kvantifikacija genske ekspresije, analiza mikroRNA i nekodirajuće RNA, genotipizacija SNP, detekcija varijanti broja kopija, detekcija rijetkih mutacija, detekcija genetski modificiranih organizama i otkrivanje infektivnih agenasa.
Koje su sličnosti između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u realnom vremenu?
- Ugniježđeni i PCR testovi u realnom vremenu su modifikacije konvencionalnog PCR testa.
- Sve tri tehnike pojačavaju DNK uzorke.
- Njihovi proizvodi se mogu koristiti u sekvenciranju ili analizi.
- Ovi testovi zahtijevaju prajmere.
Koja je razlika između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u realnom vremenu?
Konvencionalni PCR je tehnika razvijena za amplifikaciju specifičnih sekvenci DNK. U međuvremenu, Nested PCR je modifikacija konvencionalnog PCR-a koja se sastoji od dvije uzastopne reakcije amplifikacije, a PCR u realnom vremenu je varijanta konvencionalnog PCR-a koji je u stanju kvantificirati amplificirani proizvod. Dakle, ovo je ključna razlika između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u realnom vremenu. Za razliku od konvencionalnog i PCR-a u realnom vremenu, ugniježđeni PCR koristi dva seta prajmera. Štaviše, postoje dvije uzastopne reakcije amplifikacije u ugniježđenom PCR-u kako bi se smanjila nespecifična amplifikacija. osim toga, konvencionalni i PCR testovi u realnom vremenu ne sadrže dvije sekvencijalne reakcije amplifikacije.
Sljedeća infografika navodi razlike između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u realnom vremenu u obliku tabele radi usporedbe.
Sažetak – konvencionalni vs ugniježđeni vs PCR testovi u realnom vremenu
Konvencionalni PCR je prva tehnika razvijena za amplifikaciju specifičnih fragmenata DNK. Ugniježđeni PCR i PCR u realnom vremenu su dvije varijante konvencionalnog PCR-a. Postoje dvije sekvencijalne reakcije amplifikacije i upotreba dva seta prajmera u ugniježđenom PCR-u. PCR u realnom vremenu je razvijen za kvantifikaciju amplificiranog PCR proizvoda. Dakle, ovo rezimira razliku između konvencionalnih ugniježđenih i PCR testova u realnom vremenu.
