Ključna razlika – RAPD vs RFLP
Genetski markeri se koriste u molekularnoj biologiji za identifikaciju genetskih varijacija između pojedinaca i vrsta. Nasumično pojačana polimorfna DNK (RAPD) i polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) su dva važna molekularna markera koja se rutinski koriste u laboratorijama. RAPD se izvodi sa kratkim i proizvoljnim oligonukleotidnim prajmerima, a zasniva se na nasumičnoj amplifikaciji višestrukih lokacija u šablonskoj DNK organizma. RFLP se izvodi sa specifičnom restrikcijskom endonukleazom, a zasniva se na polimorfizmu nastalih restrikcijskih fragmenata i hibridizaciji. Ključna razlika između RAPL-a i RFLP-a je u tome što je RAPD vrsta PCR tehnike koja se izvodi bez prethodnog znanja o sekvenci, dok RFLP nije uključen u PCR i zahtijeva prethodno poznavanje sekvence za izvođenje tehnike.
Šta je RAPD?
RAPD je koristan molekularni marker u molekularnoj biologiji. To je brza i laka tehnika. RAPD se može definirati kao metoda koja rezultira polimorfnim DNK sekvencama kao rezultatom nasumične amplifikacije višestrukih lokacija ciljnog DNK šablona. RAPD koristi kratke oligonukleotidne prajmere sa proizvoljnim sekvencama za PCR amplifikaciju. Prajmeri su umjetno sintetizirani bez prethodnog znanja o sekvenci. Stoga se smatra lakom i korisnom tehnikom.
Sljedeći glavni koraci su uključeni u RAPD.
- Izdvajanje ciljne DNK
- Amplifikacija višestrukih lokacija ciljne DNK korištenjem nasumično odabranih prajmera
- Gel elektroforeza amplificiranih PCR proizvoda
- Bojenje etidij bromidom i identifikacija polimorfizma
Kao rezultat varijacije u žarenju prajmera, tokom amplifikacije nastaju različiti fragmenti različitih dužina. Stoga su obrasci traka na gelovima različiti među pojedincima i vrstama. Dakle, RAPD omogućava otkrivanje genetske varijacije među organizmima u identifikaciji i diferencijaciji.
RAPD se primjenjuje u različitim studijama molekularne biologije kao što su identifikacija genetske razlike između blisko povezanih vrsta, mapiranje gena, DNK otisak prsta, identifikacija nasljednih bolesti, itd.
Slika 01: RAPD
Šta je RFLP?
Polimorfizmi dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) je molekularni marker koji se koristi u molekularnoj biologiji za identifikaciju genetskih varijacija u homolognim sekvencama DNK. To je prvi genetski marker razvijen za DNK otiske prstiju. Svi organizmi proizvode jedinstvene DNK profile kada su ograničeni specifičnim restrikcijskim enzimima. RFLP služi kao važan alat u proizvodnji jedinstvenih DNK profila pojedinaca i otkrivanju genetskih varijacija među njima. Kada se uzorci DNK probavljaju specifičnim restrikcijskim endonukleazama, to daje različite DNK profile koji su jedinstveni za svakog pojedinca. Stoga je princip ove metode otkrivanje genetske varijacije među organizmima restrikcijom homologne DNK specifičnim restrikcijskim enzimima i analiza polimorfizma dužine fragmenta putem gel elektroforeze i blotinga. Obrasci upijanja su jedinstveni za svaki organizam i karakterišu specifične genotipove.
Sljedeći koraci su uključeni u RFLP.
- Izolacija dovoljne količine DNK iz uzoraka
- Fragmentacija uzoraka DNK sa specifičnim restrikcijskim endonukleazama u kratku sekvencu
- Razdvajanje dobijenih fragmenata različitih dužina elektroforezom agaroznog gela.
- Prenos gel profila u membranu Southern blottingom
- Hibridizacija membrane sa označenim sondama i analiza polimorfizma dužine fragmenta u svakom profilu
RFLP ima različite aplikacije kao što su dijagnoza nasljednih bolesti, mapiranje genoma, identifikacija kriminalaca u forenzičkim studijama, testiranje očinstva, itd.
Slika 02: RFLP genotipizacija
Koja je razlika između RAPD-a i RFLP-a?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD je molekularni marker zasnovan na nasumičnim prajmerima i PCR-u. | RFLP je molekularni marker zasnovan na proizvodnji fragmenata ograničenja dužine. |
| Potreban uzorak | |
| Mali DNK uzorci su dovoljni za RAPD analizu. | Za RFLP analizu potrebna je velika količina ekstrahovanog DNK uzorka. |
| Vrijeme | |
| RAPD je brz proces. | RFLP je dugotrajan proces. |
| Primer Use | |
| Koriste se nasumični prajmeri i isti prajmeri se mogu koristiti za različite vrste. | Probe specifične za vrstu se koriste u RFLP-u za hibridizaciju. |
| Pouzdanost | |
| Pouzdanost tehnike je manja u poređenju sa RFLP-om. | RFLP je pouzdana tehnika. |
| Blotting | |
| RAPD uključuje Southern blotting. | Southern blotting je jedan korak RFLP-a. |
| Detekcija alelnih varijacija | |
| Alelne varijacije ne mogu biti otkrivene od strane RAPD-a. | Alelne varijacije se mogu otkriti pomoću RFLP-a. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD ne zahtijeva prethodno znanje o sekvenci. | Za projektovanje sonde potrebno je prethodno znanje o sekvenci. |
| PCR | |
| PCR je uključen u RAPD | PCR nije uključen u RFLP. |
| Reproducibilnost | |
| RAPD ima nisku ponovljivost | RFLP ima visoku ponovljivost u poređenju sa RAPD-om. |
Sažetak – RAPD vs RFLP
RAPD i RFLP su važni markeri koji se koriste u molekularnoj biologiji. Obje metode mogu otkriti genetske varijacije među organizmima. RAPD se izvodi pomoću nasumičnih prajmera. RFLP se izvodi upotrebom specifičnih restrikcijskih enzima. Obje metode proizvode DNK profile jedinstvene za pojedinačne organizme. RAPD uključuje relativno malo koraka nego RFLP. Ali daje manje pouzdane i ponovljive rezultate od RFLP. Ovo je glavna razlika između RAPD-a i RFLP-a.
