Ključna razlika – AFLP vs RFLP
DNK studije imaju ogromnu važnost u razumijevanju i određivanju filogenetskih odnosa, dijagnosticiranju genetskih bolesti i mapiranju genoma organizma. Nekoliko tehnika povezanih s analizom DNK također se koristi za identifikaciju određenog gena ili sekvence DNK u grupi nepoznate DNK. Poznati su kao molekularni markeri. Pojačani polimorfizam dužine fragmenata (AFLP) i polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) su dva takva molekularna markera (metode) razvijena u molekularnoj biologiji za otkrivanje genetskih varijacija između organizama. Obje metode su podjednako važne i imaju prednosti i nedostatke. Ključna razlika između AFLP i RFLP je u tome što AFLP uključuje selektivno PCR amplifikaciju digestirane DNK dok RFLP ne uključuje selektivnu PCR amplifikaciju DNK fragmenata.
Šta je AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) je važan alat u molekularnoj biologiji i intenzivno se koristi u analizi genetskih varijacija. AFLP se zasniva na specifičnoj PCR amplifikaciji fragmentirane genomske DNK i detekciji polimorfizma autoradiografima putem gel elektroforeze. AFLP uvelike doprinosi identifikaciji genetskih razlika u sojevima ili blisko srodnim vrstama različitih kraljevstava uključujući biljke, životinje, bakterije i gljive. AFLP se može provesti s malim količinama nepoznatih uzoraka DNK. Ne zahtijeva prethodno poznavanje sekvence i projektovanje sondi.
Koraci AFLP-a
- Izolacija DNK
- Probava DNK restrikcijskim endonukleazama
- Ligacija ograničenih DNK fragmenata sa adapterima
- Selektivna amplifikacija fragmenata sa specifičnim restrikcijskim mjestima
- Razdvajanje PCR proizvoda gel elektroforezom
- Vizuelizacija gel matrice autoradiografom
AFLP je osjetljivija i ponovljiva metoda koja se može koristiti u DNK profiliranju nekoliko taksona uključujući gljive, bakterije, biljke i životinje bez prethodnog znanja o sekvencama DNK. Pomaže u prepoznavanju malih razlika među pojedincima u populacijama zbog svoje vrlo osjetljive prirode. AFLP je također važan u mapiranju genoma, forenzičkim studijama, roditeljskom testiranju, genotipizaciji, itd.
Slika 01: AFLP
Šta je RFLP?
Polimorfizmi dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) je tehnika koja se koristi za otkrivanje genetskih varijacija u homolognim sekvencama DNK. To je prva metoda razvijena za profiliranje DNK. Organizmi imaju jedinstvene DNK otiske prstiju ili DNK profile. RFLP služi kao važan alat za analizu varijacija između DNK profila intraspecifičnih ili blisko povezanih organizama budući da homologne sekvence imaju različita restrikcijska mjesta (lokacije) koja su jedinstvena za određeni organizam. Kada se homologna DNK probavi specifičnim restrikcijskim endonukleazama, to će rezultirati različitim profilima DNK koji su jedinstveni za svakog pojedinca. Stoga je princip ove metode otkrivanje genetske varijacije među organizmima restrikcijom homologne DNK specifičnim restrikcijskim enzimima i analiza polimorfizma dužine fragmenta putem gel elektroforeze i blotinga. Obrasci upijanja su jedinstveni za svaki organizam i karakterišu specifične genotipove.
Koraci RFLP-a
- Izolacija dovoljne količine DNK iz uzoraka
- Fragmentacija DNK uzoraka sa specifičnim restrikcijskim endonukleazama u kratku sekvencu
- Razdvajanje dobijenih fragmenata različitih dužina elektroforezom agaroznog gela.
- Prenos gel profila u membranu Southern blottingom
- Hibridizacija membrane sa označenim sondama i analiza polimorfizma dužine fragmenta u svakom profilu
RFLP je veoma važna tehnika u otkrivanju nasljeđa bolesti i otkrivanju rizika od pojave bolesti među članovima porodice. RFLP se takođe često koristi u mapiranju genoma, identifikaciji kriminalaca u forenzici, testiranju očinstva, itd. RFLP takođe ima nekoliko ograničenja. RFLP zahtijeva prethodno poznavanje podataka o sekvenci za dizajniranje sondi za hibridizaciju. Takođe zahteva izolaciju dovoljne količine DNK iz uzorka za analizu, što je teško u forenzičkim studijama.
Slika 01: RRFLP mapiranje
Koja je razlika između AFLP-a i RFLP-a?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP uključuje selektivnu PCR amplifikaciju digestirane DNK. | RFLP ne uključuje PCR osim ako nije PCR-RFLP. |
| Sequence Knowledge | |
| Prethodno poznavanje sekvence nije potrebno. | Za dizajnirane RFLP sonde potrebno je prethodno znanje o sekvenci. |
| Pouzdanost | |
| Ovo je pouzdanije. | Ovo je manje pouzdano u poređenju sa AFLP-om. |
| Efikasnost u otkrivanju polimorfizma | |
| Ovo ima veću efikasnost u otkrivanju polimorfizma nego RFLP. | Ovo je manje efikasno u poređenju sa AFLP-om. |
| Cijena | |
| Ovo je malo skupo u poređenju sa RFLP. | Ovo je jeftinije u poređenju sa AFLP-om. |
| Aplikacije | |
| AFLP-ovi su primijenjeni na mapiranje genoma, DNK otiske prstiju, studije genetske raznolikosti, testiranje očinstva i forenziku | RFLP analiza je važan alat u mapiranju genoma, lokalizaciji gena za genetske poremećaje, određivanju rizika od bolesti i testiranju očinstva. |
Sažetak – AFLP vs RFLP
AFLP i RFLP su dvije tehnike koje se koriste kao genetski markeri za procjenu raznolikosti i procjenu genetskih odnosa u molekularnoj biologiji. AFLP služi kao efikasna i osjetljiva metoda za detekciju genetskog polimorfizma između organizama od RFLP. Međutim, iako obje ove metode imaju različitu efikasnost u otkrivanju genetskih varijacija, one se i dalje koriste za DNK otiske prstiju i dijagnozu bolesti.
