Ključna razlika – mrlja po gramu naspram brze kiseline
Bakterije su vrlo mali mikroorganizmi. Oni su transparentni, a njihovo otkrivanje je teško u životnim i neokaljanim uslovima. Stoga su razvijene različite metode bojenja kako bi se olakšalo otkrivanje bakterija. Postoje tri glavne vrste tehnika bojenja: jednostavno bojenje, diferencijalno bojenje i strukturno bojenje. Diferencijalno bojenje je tehnika koja koristi više od jedne boje za razlikovanje bakterija. Boj po Gramu i bojenje otporno na kiselinu najpopularnije su poznate kao diferencijalne mrlje. Bojenje po Gramu je tehnika diferencijalnog bojenja, koja razdvaja bakterije u dvije grupe poznate kao Gram-pozitivne bakterije i Gram-negativne bakterije. Boj otporan na kiselinu je diferencijalna boja koja se koristi za identifikaciju organizama otpornih na kiselinu kao što je Mycobacterium od organizama koji nisu brzi na kiselinu. Ovo je ključna razlika između bojenja po Gramu i bojenja brze kiseline.
Šta je Gram Stain?
Bojenje po Gramu je važna tehnika diferencijalnog bojenja koja se koristi za identifikaciju bakterija u mikrobiologiji. Ovu tehniku je uveo danski bakteriolog Hans Christian Gram 1884. Bojenje po Gramu kategorizira bakterije u dvije velike grupe nazvane gram pozitivne i gram negativne, koje su vrlo važne u klasifikaciji i identifikaciji bakterija. Mikrobiolozi izvode bojenje po gramu kao početni korak u karakterizaciji bakterija tokom svojih studija.
Bakterije su grupisane na osnovu razlika u njihovom ćelijskom zidu. Gram pozitivne bakterije se sastoje od debelog sloja peptidoglikana u svom ćelijskom zidu, dok se gram negativne bakterije sastoje od tankog peptidoglikanskog sloja u njihovom ćelijskom zidu. Ishod bojenja po gramu će se zasnivati na razlici u debljini peptidoglikanskog sloja ćelijskog zida.
Bojenje po Gramu se izvodi korišćenjem četiri različita reagensa i to; primarna mrlja, jedkalo, sredstvo za dekolorizaciju i protivbojno sredstvo. Kristalno ljubičasta i safranin se koriste kao primarne i protivbojne boje, dok se gram joda i 95% alkohola koriste kao mordant i dekolorizator. Osnovni koraci bojenja po gramima su sljedeći;
- Bakterijski bris se priprema na čistom staklenom predmetu, fiksira se toplinom i ohladi.
- Razmaz je preplavljen kristalno ljubičastom bojom 1 – 2 minute.
- Razmaz se ispire sporo tekućom vodom iz slavine kako bi se uklonile suvišne mrlje.
- Gram joda se nanosi na bris 1 minut.
- Razmaz se ispere sporo tekućom vodom iz slavine
- Razmaz se pere sa 95% alkohola 2 – 5 sekundi i ispere sporo tekućom vodom iz slavine.
- Razmaz je obojen safraninom 1 minut
- Razmaz se ispere sporo tekućom vodom iz slavine, osuši i posmatra pod mikroskopom.
Na kraju bojenja po gramu, gram negativne bakterije će biti uočene u ružičastoj boji, dok će gram pozitivne bakterije biti uočene u ljubičastoj boji.
Slika 01: Gram negativne i Gram pozitivne bakterije
O ishodu bojenja po gramima odlučuje debljina sloja peptidoglikana u njihovom ćelijskom zidu. Tokom koraka dekolorizacije, primarna mrlja i jedlica se lako uklanjaju sa gram negativnih bakterija i postaju bezbojne jer imaju tanak sloj peptidoglikana. Primarna mrlja se zadržava u gram pozitivnim bakterijama jer imaju debeli sloj peptidoglikana. Protiv bojenje neće biti efikasno za gram pozitivne bakterije zbog zadržavanja primarne mrlje. Tako će gram pozitivne bakterije biti vidljive u primarnoj boji mrlje, odnosno ljubičastoj boji. Kontra mrlja će obojiti gram negativne bakterije, a one će biti vidljive u boji pika, a to je boja safranina. Stoga je lako kategorizirati bakterije u dvije grupe prema boji po gramu i vrijedan je u diferencijaciji i identifikaciji bakterija.
Šta je Acid Fast?
Postojanost na kiselinu je fizičko svojstvo određenih bakterija, posebno njihova otpornost na dekolorizaciju kiselinama tokom postupaka bojenja. Jednom obojeni, ovi organizmi otporni su na postupke dekolorizacije na bazi razrijeđene kiseline i/ili etanola koji su uobičajeni u mnogim protokolima bojenja. Stoga je tim organizmima dat naziv „fast kiseline“. Ovo svojstvo se pokazuje zbog visokog nivoa voštanog materijala (mikolne kiseline) u njihovim ćelijskim zidovima. Ovaj test je kritičan za identifikaciju Mycobacterium tuberculosis.
Slika 2: Mikobakterije brze kiseline
Ovu kiselinu brzu mrlju razvio je Paul Ehrlich 1882. Ehrlichovu tehniku brze kiseline modificirao je Ziehl-Neelsen i sada se sve češće koristi. Postupak brzog bojenja kiselinom uključuje tri različita reagensa. Carbol fuschin se koristi kao primarna boja. Kiseli alkohol se koristi kao sredstvo za obezbojenje. Metilensko plavo se koristi kao kontra boja. Postupak bojenja se izvodi na sljedeći način.
- Primarna boja (carbol fuksin) se nanosi na fiksirani uzorak na stakalcu (sve ćelije će biti obojene crvenom bojom).
- Tobogan se zagrijava parom 5 minuta, čime se mrlje pravilno ubacuju u ćelije.
- Zatim se dodaje rastvor za dekolorizaciju (ovo uklanja crvenu boju sa svih ćelija osim bakterija brzih kiselina).
- Metilensko plavo se dodaje kao kontra-boja (boji sve obezbojene bakterijske ćelije).
- Bakterije brze kiseline ostaju crvene dok se nekiselinske brze bakterije boje u plavo.
Koje su sličnosti između bojenja po Gramu i brze kiseline?
- Gram mrlja i Acid fast su dvije različite tehnike bojenja.
- Obje tehnike kategoriziraju bakterije u dvije grupe.
- Obje tehnike koriste dvije mrlje i jednu dekolorizaciju.
Koja je razlika između bojenja po Gramu i brze kiseline?
Gram Stain vs Acid Fast |
|
| Bojenje po Gramu je tehnika diferencijalnog bojenja, koja razdvaja bakterije u dvije grupe Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. | Acid Fast Stain je diferencijalna boja koja se koristi za identifikaciju organizama otpornih na kiselinu od organizama koji nisu brzi na kiselinu. |
| Primarna mrlja | |
| Crystal violet je najčešće korištena primarna boja za bojenje po gramu. | Carbol fuksin je primarna boja koja se koristi za brzo kiseljenje. |
| Agent za dekolorizaciju | |
| 95% alkohola se koristi kao sredstvo za obezbojavanje u gram mrljama. | Kiseli alkohol se koristi kao sredstvo za obezbojenje u acid fast-u. |
| Counter Stain | |
| Gram mrlja koristi safranin kao kontra mrlju. | Brza kiselina koristi metilensko plavo kao kontra mrlju. |
| Zapažanje | |
| Gram negativne bakterije su uočene u pik boji, a gram pozitivne bakterije u ljubičastoj boji. | Bakterije brze kiseline su uočene u crvenoj boji, a bakterije brze na kiselinu su uočene u plavoj boji. |
Sažetak – mrlja po Gramu vs Acid Fast
Vizualizacija mikroorganizama u živom stanju je teška. Stoga se biološke mrlje i postupci bojenja intenzivno koriste za proučavanje njihovih svojstava. Diferencijalno bojenje je jedna vrsta tehnike bojenja koja se koristi za razlikovanje bakterija. Bojenje po Gramu i bojenje brzom kiselinom su dvije različite tehnike bojenja. Bojenje po Gramu razlikuje gram negativne i gram pozitivne bakterije na osnovu debljine njihovih staničnih stijenki. Brzo bojenje kiselinama razlikuje bakterije brze kiseline od bakterija brzih kiselina na osnovu sadržaja mikolne kiseline u ćelijskom zidu. Ovo je razlika između brze kiseline i bojenja po gramu.
Preuzmite PDF verziju Gram Stain vs Acid Fast
Možete preuzeti PDF verziju ovog članka i koristiti ga za vanmrežne svrhe prema napomeni o citatu. Molimo preuzmite PDF verziju ovdje Razlika između mrlja po gramu i brze kiseline.
