Ključna razlika – Sjeverni vs Južni vs Zapadni Blotting
Detekcija specifičnih sekvenci DNK, RNK i proteina je neophodna za različite vrste studija u molekularnoj biologiji. Gel elektroforeza je tehnika koja razdvaja DNK, RNK i proteine prema njihovoj veličini. Iz profila gela, određena DNK sekvenca, RNA sekvenca ili protein se detektuju posebnim tehnikama koje se nazivaju blotiranje i hibridizacija sa obeleženim sondama. Postoje tri različite metode upijanja, a to su južni, sjeverni i zapadni. Ključna razlika između Northern Southern i Western blotinga leži u tipu molekula koji detektuje iz uzorka. Southern blotting je metoda koja detektuje specifičnu sekvencu DNK iz uzorka DNK. Northern blotting je tehnika koja detektuje specifičnu sekvencu RNK iz uzorka RNK. Western blotting je metoda koja detektuje specifičan protein iz uzorka proteina.
Šta je Southern Blotting?
Southern blotting tehniku je razvio E. M. Southern 1975. za identifikaciju specifične sekvence DNK iz uzorka DNK. Ovo je prva tehnika upijanja uvedena u molekularnu biologiju. Omogućio je detekciju specifičnih gena iz DNK, specifičnih fragmenata iz DNK, itd. Postoji nekoliko koraka uključenih u Southern blotting tehniku. Oni su sljedeći.
- DNK se izoluje iz uzorka i digestira restrikcijskim endonukleazama.
- Probavljeni uzorak se odvaja elektroforezom agaroznog gela.
- DNK fragmenti u gelu se denaturiraju u jednostruke lančiće upotrebom alkalne otopine.
- Jednolančana DNK se prenosi na nitroceluloznu filtersku membranu kapilarnim prijenosom.
- Prenesena DNK je trajno fiksirana na membrani.
- Fiksna DNK na membrani je hibridizirana sa označenim sondama.
- Nevezana DNK se ispire sa membrane pranjem.
- Rentgenski film se izlaže membrani i priprema se autoradiograf.
Southern blotting se primjenjuje za različite aspekte molekularne biologije. Koristan je u RFLP mapiranju, forenzičkim studijama, metilaciji DNK u ekspresiji gena, otkrivanju mutiranih gena u genetskim poremećajima, DNK otisku prstiju, itd.
Slika 01: Southern Blotting tehnika
Šta je Northern Blotting?
Northern blotting je metoda dizajnirana za otkrivanje specifične RNA sekvence ili mRNA sekvence iz uzorka radi proučavanja ekspresije gena. Ovu tehniku su razvili Alwine, Kemp i Stark 1979. godine. Razlikuje se od sautern i western blotting tehnika zbog nekoliko koraka. Međutim, ova tehnika se također izvodi putem gel elektroforeze, blotinga i hibridizacije sa specifičnim označenim sondama i detekcijom. Northern blotting tehnika se izvodi na sljedeći način.
- RNA se ekstrahuje iz uzorka i odvaja gel elektroforezom.
- RNA se prenosi iz gela na upijajuću membranu i fiksira.
- Membrana se tretira sa označenom sondom pripremljenom od cDNA ili RNA (sonda je komplementarna specifičnoj sekvenci u uzorku).
- Sonda se inkubira sa membranom kako bi se vezala sa određenim nizom.
- Nevezane sonde se isperu.
- Hibridizirani fragmenti se detektuju autoradiografom.
Northern blotting je važan alat u otkrivanju i kvantificiranju hibridizirane mRNA, proučavanju degradacije RNK, evaluaciji poluživota RNK, otkrivanju spajanja RNA, proučavanju ekspresije gena, itd.
Slika 02: Northern Blotting
Šta je Western Blotting?
Western blotting je metoda detekcije specifičnog proteina iz mješavine proteina korištenjem obilježenih antitijela. Stoga je western blot poznat i kao imunoblot. Ovu tehniku su uveli Towbin et al 1979. godine i sada se rutinski izvodi u laboratorijama za analizu proteina. Koraci su sljedeći.
- Proteini se ekstrahuju iz uzorka
- Proteini se razdvajaju po veličini pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu
- Razdvojeni molekuli se prenose u PVDF membranu ili nitroceluloznu membranu elektroporacijom
- Membrana je blokirana zbog nespecifičnog vezivanja sa antitelima
- Preneseni proteini su vezani za primarna antitijela (antitijela označena enzimima).
- Membrana se ispere kako bi se uklonila nespecifično vezana primarna antitijela
- Vezana antitela se detektuju dodavanjem supstrata i detekcijom formiranog obojenog precipitata
Western blotting je koristan u otkrivanju anti-HIV antitijela u uzorku ljudskog seruma. Western blot se također može koristiti kao potvrdni test za infekciju hepatitisom B i definitivni test za bolest kravljeg ludila.
Slika 03: Western Blotting
Koja je razlika između Northern Southern i Western Blottinga?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Detektovana vrsta molekula | |
| Northern Blotting | Northern blotting detektuje specifičnu sekvencu RNA iz uzorka RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting detektuje specifičnu sekvencu DNK iz uzorka DNK. |
| Western Blotting | Western blotting detektuje specifičan protein iz uzorka proteina. |
| Vrsta gela | |
| Northern Blotting | Ovo koristi gel agaroze/formaldehida. |
| Southern Blotting | Ovo koristi Agarose gel. |
| Western Blotting | Ovo koristi poliakrilamidni gel. |
| Metoda upijanja | |
| Northern Blotting | Ovo je kapilarni prijenos. |
| Southern Blotting | Ovo je kapilarni prijenos. |
| Western Blotting | Ovo je električni prijenos. |
| Korišćene sonde | |
| Northern Blotting | cDNA ili RNA sonde označene radioaktivno ili neradioaktivno. |
| Southern Blotting | DNK sonde su označene radioaktivno ili neradioaktivno. |
| Western Blotting | Primarna antitela se koriste kao sonde. |
| Sistem za detekciju | |
| Northern Blotting | Ovo se radi pomoću autoradiografa, ili detekcije svjetlosti ili promjene boje. |
| Southern Blotting | Ovo se radi pomoću autoradiografa, detekcije svjetlosti ili promjene boje. |
| Western Blotting | Ovo se radi pomoću detekcije svjetlosti ili promjene boje. |
Sažetak – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting je posebna tehnika razvijena za identifikaciju specifične DNK, RNK ili proteina iz uzoraka. Postoje tri odvojena postupka upijanja, odnosno sjeverni, južni i zapadni, za otkrivanje specifične vrste molekula. Northern blotting tehnika je dizajnirana da otkrije specifičnu sekvencu RNK iz mješavine RNK. Southern blotting tehnika omogućava otkrivanje specifične sekvence DNK iz uzorka DNK, a Western blotting tehnika je razvijena za identifikaciju specifičnog proteina iz mješavine proteina.
