Ključna razlika – Nick Translation vs Primer Extension
Nick prevod i ekstenzija prajmera su dve važne tehnike koje se izvode u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između translacije nicka i ekstenzije prajmera je u tome što proces translacije nicka proizvodi obeležene sonde za druge tehnike hibridizacije, dok metoda ekstenzije prajmera identifikuje specifičnu sekvencu RNK iz mešavine i otkriva informacije o ekspresiji mRNA. Obje tehnike imaju veliki značaj i rutinski se izvode u laboratorijama za molekularna istraživanja.
Šta je Nick prevod?
Nick prijevod je važna tehnika koja se koristi za pripremu označenih sondi za različite molekularno biološke tehnike kao što su bloting, in situ hibridizacija, fluorescentna in situ hibridizacija itd. To je in vitro metoda obilježavanja DNK. DNK sonde se koriste za identifikaciju specifičnih sekvenci DNK ili RNK. Uz pomoć obilježene sonde, specifični fragmenti se mogu označiti ili vizualizirati iz složene mješavine nukleinske kiseline. Stoga se označene sonde pripremaju korištenjem različitih tehnika koje će se koristiti za različite tehnike. Nick translacija je jedna takva metoda koja proizvodi označene sonde uz pomoć enzima DNase 1 i DNK polimeraze 1.
Proces prevođenja nicka počinje sa aktivnošću enzima DNase 1. DNaza 1 uvodi brazde u fosfatnu kičmu dvolančane DNK cijepanjem fosfodiestarskih veza između nukleotida. Jednom kada se nik stvori slobodna 3’ OH grupa nukleotida, a na nju će djelovati enzim DNK polimeraze 1. Aktivnost egzonukleaze od 5’ do 3’ DNK polimeraze 1 uklanja nukleotide iz ureza prema 3’ smjeru lanca DNK. Istovremeno, polimerazna aktivnost enzima DNK polimeraze 1 djeluje i dodaje nukleotide kako bi zamijenili uklonjene nukleotide. Ako su nukleotidi bili obilježeni, do zamjene će doći obilježeni nukleotidi i to će označiti DNK za identifikaciju. Ova novosintetizirana označena DNK može se koristiti kao sonde u različitim reakcijama hibridizacije u molekularnoj biologiji.
Slika 01: Proces prevođenja nicka
Šta je ekstenzija Primera?
Primer ekstenzija je tehnika koja se koristi za pronalaženje specifične RNA sekvence iz RNK mješavine i lociranje 5’ kraja mRNA transkripta. Također se koristi za proučavanje strukture RNK i ekspresije. Metoda ekstenzije prajmera izvodi se sa obeleženim prajmerima ili sa obeleženim nukleotidima. Ako se koriste obilježeni prajmeri, to isključuje potrebu obilježavanja nukleotida koji se koriste za sintezu cDNK. Postoji nekoliko koraka u ovoj tehnici. Počinje ekstrakcijom RNK iz uzorka. Zatim se u smjesu dodaje obilježeni oligonukleotidni prajmer zajedno sa potrebnim sastojcima za sintetizaciju cDNK specifične RNK sekvence. Prajmer žari komplementarnom sekvencom iz smjese. Koristeći prajmer žarenu sekvencu kao šablon, enzim reverzna transkriptaza sintetiše komplementarnu DNK (cDNK) RNA sekvence. Prajmersko žarenje i reverzna transkripcija se dešavaju samo kada je specifična RNK sekvenca prisutna u uzorku. Konačno, kada se izvrši elektroforeza denaturirajućeg gela, može se odrediti veličina RNA sekvence. Takođe je lako pronaći +1 bazu sekvence mRNA (mjesto inicijacije transkripcije) metodom ekstenzije prajmera. Količina mRNA prisutne u uzorku može se kvantificirati ovom metodom ako se koristi višak prajmera.
Slika 02: Produžetak prajmera
Koja je razlika između Nick prevoda i Primer ekstenzije?
Nick prevod vs ekstenzija Primer |
|
| Nick prijevod je proces koji stvara označene DNK sonde za različite reakcije hibridizacije. | Primer ekstenzija je tehnika koja se koristi za pronalaženje specifične RNK ili za proučavanje ekspresije gena. |
| Upotrebljeni enzimi | |
| Dnaza 1 i enzimi DNK polimeraze se koriste. | Koristi se enzim reverzne transkriptaze. |
| Važnost | |
| Nick prevod olakšava označavanje specifične DNK sekvence. | Proširenje prajmera omogućava detekciju specifične veličine sekvence mRNA i količine prisutne u uzorku. |
Sažetak – Nick prevod vs ekstenzija Primer
Nick prijevod je metoda koja se koristi za sintetizaciju obilježenih sondi na osnovu aktivnosti enzima DNase 1 i E coli DNK polimeraze 1. To je in vitro metoda koja se koristi u laboratorijama prije različitih tehnika hibridizacije. Tokom translacije nicka, aktivnost egzonukleaze 5’-3’ DNK polimeraze 1 uklanja nukleotide ispred nicka, a aktivnost polimeraze DNK polimeraze 1 zamjenjuje uklonjene nukleotide označenim nukleotidima iza nicka. Proširenje prajmera je metoda koja se koristi za otkrivanje specifičnog RNA transkripta iz mješavine i kvantificiranje veličine i količine RNK od interesa. Ovo je razlika između prevoda nicka i ekstenzije primera.
