Ključna razlika – nitroceluloza vs PVDF
Western blotting je metoda koja omogućava detekciju i kvantifikaciju specifičnih proteina iz uzorka proteina. Pouzdanost tehnike zavisi od izbora ispravne membrane za apsorpciju proteina iz gela. Postoje različite vrste mikroporoznih membrana. Nitrocelulozne i PVDF membrane su dvije takve membrane koje istraživači preferiraju zbog njihovih posebnih atributa u odnosu na druge tipove membrana. Odabir između nitroceluloze ili PVDF-a je također još jedan izazov u western blotingu. I nitroceluloza i PVDF imaju visok kapacitet apsorpcije proteina. Ključna razlika između nitroceluloze i PVDF membrane je u tome što nitrocelulozne membrane nemaju sposobnost uklanjanja antitijela i ponovnog korištenja membrane za ponovno ispitivanje antitijela, dok PVDF membrane imaju sposobnost uklanjanja i ponovne upotrebe.
Šta je nitroceluloza?
Nitroceluloza je polimer proizveden obradom celuloze azotnom kiselinom i koristi se za izradu mikroporoznih membrana u molekularnoj biologiji, posebno za tehnike upijanja kao što su Southern, Northern i Western blotting. Veličina pora nitroceluloznih membrana kreće se od 3 do 20 µm. Nitrocelulozne mikroporozne membrane olakšavaju detekciju imunohemijske reakcije koja se dešava na površini membrane. Stoga se nitrocelulozne membrane često koriste za imobilizaciju proteina i detekciju specifičnih proteina u western blottingu. Nitrocelulozne membrane također mogu imobilizirati glikoproteine i nukleinske kiseline.
Nitrocelulozne membrane se preferiraju u testovima bočnog protoka zbog nekoliko karakteristika. Nitrocelulozne membrane apsorbuju proteine u visokoj koncentraciji. Rastvarač koji se koristi za vlaženje membrane ne umanjuje apsorpciju proteina nitrocelulozne membrane. Nitrocelulozne membrane mogu se lako rezati na željenu veličinu gela i prenositi proteine iz gela na membranu električnim ili kapilarnim prijenosom. Nitroceluloza omogućava brži protok proteina kroz membranu sa visokim potencijalom vezivanja. Nitroceluloza pokazuje poboljšanu snagu rukovanja. Još jedan poseban atribut nitrocelulozne membrane je da se lako može zalijepiti vodootpornim ljepilima koji nisu otapali na različite plastične podloge.
Slika 01: Nitrocelulozna membrana za western blotting
Šta je PVDF?
Poliviniliden difluorid (PVDF) je fluoropolimer proizveden polimerizacijom viniliden difluorida i ima visoku sposobnost imobilizacije proteina. Stoga se mikroporozne membrane napravljene od PVDF-a koriste u Western blotting tehnikama za analizu specifičnih proteina iz mješavine proteina. PVDF membrane se također mogu koristiti za analizu aminokiselina i sekvenciranje proteina. Najvažnija karakteristika PVDF membrane preko nitrocelulozne membrane je da se može lako skinuti sa antitela i ponovo koristiti za sledeće sonde za antitela.
PVDF membrane su deblje od nitroceluloznih membrana; dakle, otporniji na oštećenja tokom ponovne upotrebe. PVDF membrane su visoko hidrofobne. Stoga ih prije upotrebe moraju potopiti u metanol ili izopropanol.
Koja je razlika između nitroceluloze i PVDF-a?
Nitroceluloza vs PVDF |
|
| Nitroceluloza je polimer sastavljen od celuloze. | PVDF je fluoropolimer proizveden polimerizacijom viniliden difluorida. |
| Veličina pore membrane | |
| Tipične veličine pora su 0,1, 0,2 ili 0,45μ | Tipične veličine pora su 0,1, 0,2 ili 0,45μm |
| Kapacitet vezivanja proteina | |
| Nitroceluloza ima kapacitet vezivanja proteina od 80 do 100 μg/cm2. | PVDF ima kapacitet vezivanja proteina od 170 do 200 μg/cm2. |
| Osjetljivost | |
| Ovo ima nisku osjetljivost u poređenju sa PVDF-om. | Ovo ima visoku osjetljivost. |
| Detekcija slabo izraženih proteina | |
| Budući da je osjetljivost nitroceluloznih membrana niska, nije pogodna za detekciju nisko izraženih proteina. | Ovo je pogodnije za detekciju slabo izraženih proteina zbog svoje visoke osjetljivosti. |
| Pozadinski šum | |
| Ovo ima niži šum u pozadini | Ovo ima veću pozadinu buke. |
| Interakcije sa proteinima | |
| Proteinski molekuli se vezuju za nitrocelulozne membrane kroz hidrofobne interakcije. | Proteini se vezuju za PVDF membrane kroz hidrofobne i dipolne interakcije. |
| Priroda membrane | |
| Nitroceluloza je krhka i lomljiva. Međutim, dostupne su verzije nitroceluloze, koje su otporne. | PVDF je izdržljiviji i ima veću hemijsku otpornost. |
| Mogućnost skidanja i ponovne upotrebe | |
| Nitroceluloza može imati poteškoća sa skidanjem i ponovnim ispitivanjem bez gubitka signala. | PVDF je idealan za ponovno ispitivanje i sekvenciranje aplikacija. |
| Pogodnost | |
| Nitroceluloza je idealna za otkrivanje proteina niske molekularne težine. | PVDF je pogodniji za otkrivanje proteina veće molekularne težine. |
| Druge upotrebe | |
| Nitroceluloza se može koristiti za analizu nukleinskih kiselina i tačkica/slot blotting. | PVDF se može koristiti za sekvenciranje proteina i sisteme za analizu čvrste faze. |
| Cijena | |
| Ovo je jeftinije od PVDF membrana. | Ovo je skuplje od nitroceluloznih membrana. |
| Potreba za predkvašenjem | |
| Nitrocelulozne membrane ne zahtijevaju prethodno namakanje metanolom | PVDF membrane zahtijevaju prethodno namakanje metanolom. |
Sažetak – Nitroceluloza vs PVDF
Nitrocelulozne membrane su bile prve membrane koje su se komercijalno koristile za analizu bočnog protoka. Imaju visok kapacitet za apsorpciju proteina. Stoga se nitrocelulozne membrane koriste u western blottingu. PVDF je još jedna vrsta membrane koja se koristi u Western blottingu i također ima visok kapacitet apsorpcije proteina. Oba tipa se koriste u Western blottingu za analizu proteina. Međutim, PVDF membrane imaju više posebnih atributa, što ih čini pogodnijim od nitroceluloznih membrana za western blotting. Ali, nitrocelulozne membrane su pogodnije za detekciju proteina niske molekularne težine, PVDF membrane su pogodnije za detekciju proteina visoke molekularne težine. Ovo je razlika između nitroceluloznih i PVDF membrana.
