Ključna razlika – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidi su osnovne strukturne jedinice i gradivni blokovi DNK. Molekul DNK se sastoji od polinukleotidnog lanca. U DNK se nalaze četiri različita nukleotida. Ovi nukleotidi se sastoje od četiri različite azotne baze pod nazivom A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Redoslijed nukleotida u molekuli DNK ima veliku važnost jer kodira važnu genetsku informaciju za rast i razvoj organizama. Sekvenciranje DNK se odnosi na proces koji određuje preciznu sekvencu nukleotida DNK. Postoje različite metode sekvenciranja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje i Sanger DNK sekvenciranje su dvije metode sekvenciranja DNK koje pripadaju prvoj generaciji sekvenciranja. Maxam Gilbertova procedura sekvenciranja određuje baznu sekvencu kemijskim cijepanjem 5' krajnih obilježenih DNK fragmenata prvenstveno na svakom od četiri nukleotida i gel elektroforezom. Sangerova procedura sekvenciranja određuje nukleotidnu sekvencu sintezom jednolančane DNK korištenjem DNK polimeraze i dideoksinukleotida i gel elektroforeze. Ovo je ključna razlika između Maxama Gilberta i Sanger Sequencing.
Šta je Maxam Gilbert sekvenciranje?
Maxam Gilbert sekvenciranje, takođe poznato kao metoda hemijskog sekvenciranja, je tehnika koja je razvijena da odredi redosled nukleotida u DNK. Ovu metodu su predstavili W alter Gilbert i Alan Maxam 1976. godine i postala je popularna jer se može izvoditi direktno s pročišćenom DNK. Metoda Maxam Gilberta pripada prvoj generaciji sekvenciranja DNK, i to je bila prva metoda sekvenciranja koju su naučnici široko koristili.
Osnovni princip ove metode leži u ograničavanju krajnjih obeleženih DNK fragmenata na specifičnim bazama hemikalijama i uslovima specifičnim za bazu i odvajanju obeleženih fragmenata elektroforezom kao što je prikazano na slici 01. Fragmenti se odvajaju u skladu s tim. na njihove veličine na gelu. Pošto su fragmenti označeni, sekvenca molekula DNK se može lako zaključiti.
Maxam Gilbertova metoda koristi hemikalije specifične za bazu za razbijanje DNK na određenim bazama. Dve uobičajene hemikalije pod nazivom dimetil sulfat i hidrazin hemikalije se koriste za selektivni napad na purine i pirimidine, respektivno.
Maxam Gilbert metoda sekvenciranja se izvodi kroz nekoliko koraka kako slijedi.
- Pročišćavanje DNK sekvence upotrebom restrikcijskih endonukleaza
- Označavanje krajeva DNK fragmenata dodavanjem radioaktivnih fosfata
- Pročišćavanje označenih fragmenata od neobilježenih fragmenata gel elektroforezom
- Odvajanje krajnje označene DNK u četiri epruvete i posebno tretiranje hemikalijama specifičnim za bazu
- Elektroforeza sadržaja svake epruvete na posebnim linijama na gelu i odvajanje fragmenata prema njihovoj dužini.
- Detekcija fragmenata autoradiografom.
Slika 01: Maxam Gilbert Sequencing
Šta je Sanger sekvenciranje?
Sanger Sequencing je metoda sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegove kolege 1977. za određivanje bazne sekvence datog DNK fragmenta. Također je poznat kao sekvenciranje prekida lanca ili metoda sekvenciranja Dideoxy. Ova metoda radi na principu selektivne inkorporacije dideoksinukleotida koji završavaju lanac (ddNTP) kao što su ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNK polimeraze tokom sinteze jednolančane DNK kako bi se prekinulo formiranje lanca. Dideoksinukleotidi nemaju 3’ OH grupe za formiranje fosfodiestarskih veza sa susjednim nukleotidom. Dakle, formiranje lanca prestaje kada se ddNTP ugradi u novoformirani lanac tokom sekvenciranja sangera.
U ovoj metodi, četiri odvojene reakcije sinteze DNK (PCR) se izvode u četiri odvojene epruvete sa jednim tipom ddNTP. Za epruvete za PCR isporučuju se i drugi zahtjevi, uključujući prajmere, dNTP, Taq polimerazu, specifične uslove, itd. Četiri odvojene reakcije se izvode u četiri epruvete sa četiri mješavine. Nakon PCR reakcija, rezultujući DNK fragmenti se toplotno denaturiraju i odvajaju gel elektroforezom. Zatim se fragmenti vizualiziraju korištenjem ili označenog (radioaktivnog ili fluorescentnog) prajmera ili dNTP-a kao što je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između Maxama Gilberta i Sangerovog sekvenciranja?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert sekvenciranje je prva tehnika razvijena za sekvenciranje DNK. | Sangerova metoda sekvenciranja uvedena je nakon metode sekvenciranja Maxama Gilberta. |
| Upotreba | |
| Ova metoda se rijetko koristi. | Sanger sekvenciranje se rutinski koristi za sekvenciranje. |
| Upotreba opasnih hemikalija | |
| Koristi opasne hemikalije. | Upotreba opasnih hemikalija je ograničena u poređenju sa metodom Maxama Gilberta. |
| Označavanje za detekciju | |
| Ova metoda koristi radioaktivni P32 za označavanje krajeva DNK fragmenata. | Sanger sekvenciranje koristi radioaktivno ili fluorescentno označene ddNTPs. |
Sažetak – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert i Sanger sekvenciranje su dvije vrste tehnika sekvenciranja DNK koje spadaju u prvu generaciju sekvenciranja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje je prva metoda uvedena za sekvenciranje DNK 1976. godine, a izvodi se razbijanjem krajnjih obilježenih DNK fragmenata hemikalijama specifičnim za bazu. Stoga je poznato kao hemijsko sekvenciranje. Sangerova metoda sekvenciranja uvedena je 1977. godine i zasniva se na ddNTP vođenim reakcijama završetka lanca. Sangerova metoda sekvenciranja popularnija je od metode Maxam Gilberta zbog nekoliko nedostataka Maxam Gilbert metode kao što su pretjerana potrošnja vremena, upotreba opasnih hemikalija itd. Ovo je razlika između Maxama Gilberta i Sangerovog sekvenciranja.
