Ključna razlika – RT PCR vs QPCR
Lančana reakcija polimeraze je tehnika koja se koristi za amplifikaciju specifičnog regiona DNK in vitro. Zahvaljujući pronalasku ove tehnike od strane Karyja Mullisa 1983. godine, naučnici su u mogućnosti da naprave hiljade do milione kopija specifičnih fragmenata DNK u istraživačke svrhe. Trenutno je postala uobičajena tehnika koja se rutinski izvodi u kliničkim i istraživačkim laboratorijama za širok spektar primjena. Postoje varijacije tradicionalne PCR tehnike kao što su RT PCR, ugnježđeni PCR, multipleksni PCR, Q PCR, RT – QPCR, itd. RT PCR i Q PCR su dvije važne varijacije PCR. Ključna razlika između RT PCR i Q PCR je u tome što se RT PCR koristi za otkrivanje ekspresije gena kroz stvaranje komplementarnih DNK (cDNA) transkripata iz RNK dok se Q PCR koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda u realnom vremenu koristeći fluorescentne boje.
Šta je RT PCR?
lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RT PCR) je varijanta PCR-a koja se koristi za otkrivanje ekspresije RNK. To je vrlo važna metoda za otkrivanje ekspresije mRNA u tkivima. RT PCR se koristi kada je početni materijal uzorka RNK. U RT PCR, šablonska mRNA se prvo pretvara u komplementarnu DNK. Ovaj korak katalizira enzim reverzna transkriptaza i proces je poznat kao reverzna transkripcija. Drugo, tradicionalni PCR se koristi za novosintetizovanu cDNK za amplifikaciju.
RT PCR je vrlo osjetljiva tehnika koja zahtijeva relativno malu količinu uzorka RNK. RT PCR se obično koristi u dijagnozi i kvantifikaciji RNA vrsta, posebno RNA virusa kao što su virus humane imunodeficijencije i virus hepatitisa C.
Slika 01: RT PCR tehnika
Šta je QPCR?
Kvantitativni PCR (QPCR) je varijanta PCR-a koja se koristi za kvantitativno mjerenje PCR proizvoda. Takođe se naziva lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu jer meri pojačanje u realnom vremenu pomoću PCR mašine u realnom vremenu. To je pogodna metoda za određivanje količine ciljne sekvence ili gena prisutnog u uzorku. Zanimljiva karakteristika QPCR-a je da kombinuje i amplifikaciju i pravu kvantifikaciju u jednom koraku. Stoga se potreba za gel elektroforezom u detekciji može eliminirati QPCR tehnikom. QPCR koristi fluorescentne boje za označavanje PCR proizvoda tokom PCR reakcija koje na kraju dovode do direktne kvantifikacije. Kada se PCR proizvodi akumuliraju, fluorescentni signali se također akumuliraju i to će biti izmjereno mašinom u realnom vremenu. QPCR se može kombinovati sa RT PCR. Poznata je kao RT – QPCR ili QRT – PCR i smatra se najmoćnijom, najosjetljivijom i kvantitativnom metodom za detekciju nivoa RNK u ćelijama ili tkivima.
SYBR Green i Taqman su dvije metode koje se koriste za otkrivanje ili praćenje procesa amplifikacije PCR-a u realnom vremenu. SYBR Green metoda se provodi korištenjem fluorescentne boje zvane SYBR green i detektuje pojačanje vezivanjem boje kako bi se proizvela dvolančana DNK. Taqman se izvodi pomoću sondi sa dvostrukom oznakom i detektuje pojačanje degradacijom sonde Taq polimerazom i oslobađanjem fluorofora kao što je prikazano na slici 02. Obje metode prate napredak procesa amplifikacije i izvještavaju o količini proizvoda u realnom vremenu.
PCR u realnom vremenu ima širok spektar primena kao što su kvantifikacija ekspresije gena, analiza mikroRNA i nekodirajuće RNK, SNP genotipizacija, detekcija varijanti broja kopija, detekcija retkih mutacija, detekcija genetski modifikovanih organizama, detekcija infektivnih agenasa, itd.
Slika 02: Kvantitativna PCR tehnika
Koja je razlika između RT PCR-a i QPCR-a?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR je tehnika koja se koristi za otkrivanje ekspresije gena amplifikacijom. | QPCR je tehnika koja umnožava DNK i kvantifikuje PCR proizvode u realnom vremenu. |
| Učešće enzima reverzne transkriptaze | |
| Enzim reverzna transkriptaza se koristi za RT PCR. | Enzim reverzna transkriptaza se ne koristi za QPCR. |
| Upotreba fluorescentno označenih molekula | |
| Fluorescentno označene boje ili sonde se ne koriste za RT PCR. | Fluorescentno označene boje ili sonde se koriste za QPCR. |
| Kvantifikacija PCR proizvoda | |
| Osim ako nije spojen sa QPCR, RT PCR ne kvantifikuje PCR proizvod. | QPCR kvantitativno izmjerite PCR proizvod. |
| Početni materijal | |
| Početni materijal je mRNA. | Početni materijal je DNK. |
| Sinteza cDNK | |
| Komplementarna DNK se proizvodi tokom RT PCR-a. | Komplementarna DNK se ne proizvodi tokom QPCR-a. |
Sažetak – RT PCR vs QPCR
RT PCR i QPCR su dvije verzije tradicionalnog PCR-a. RT PCR tehnika se izvodi za uzorke mRNA i pokreće je reverzna transkripcija i proizvodnja cDNK. QPCR se koristi za kvantifikaciju PCR proizvoda tokom termičkih ciklusa PCR u realnom vremenu koristeći fluorescentne boje ili označene sonde. U QPCR-u, količina PCR proizvoda je predstavljena fluorescentnim signalima koje emituje uzorak. RT PCR se popularno koristi kao proces amplifikacije, dok se QPCR obično koristi kao proces kvantifikacije. Ovo je razlika između RT PCR i QPCR.
