Ključna razlika između Golden Gate-a i Gibson Assembly-a je u tome što se Golden Gate oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koja će biti klonirana, dok se Gibson Assembly ne oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence za biti kloniran.
Tokom proteklih decenija, molekularni naučnici su razvili različite standardizovane procedure koje omogućavaju lakše sastavljanje višestrukih DNK fragmenata u jedan komad. Stoga, metode kloniranja kao što su ligacija restrikcijskim enzimima, kloniranje prolaza, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly i TOPO kloniranje se široko koriste od strane istraživača u naučnim eksperimentima. Stoga su Golden Gate i Gibson Assembly dvije metode molekularnog kloniranja koje omogućavaju sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad.
Šta je Golden Gate Assembly?
Golden Gate je metoda molekularnog kloniranja koja olakšava sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Ova metoda se oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koja se klonira. Nastala je 1996. godine. Ova tehnika koristi restrikcijske enzime tipa IIS i T4 DNK ligazu. Ovi enzimi sijeku DNK izvan mjesta prepoznavanja. Oni mogu stvoriti nepalindromske previse. Stoga se višestruki fragmenti DNK mogu sastaviti korištenjem kombinacija previsokih sekvenci.
Slika 01: Golden Gate
Procedura montaže Golden Gate
Golden Gate tehnika ima tri glavna koraka u svom postupku:
- kreiranje prepusta u vektoru kloniranja,
- sastavljanje višestrukih DNK umetaka upotrebom sekvenci specifičnih za fragmente u prevjesima, i
- ligacija.
Golden Gate sklop koristi kružne vektore kloniranja (destinacioni vektor). Nadalje, u ovoj metodi, restrikcijsko mjesto se eliminira iz ligiranog proizvoda kako bi se istovremeno izvršila probava i ligacija. Tipični protokol termičkog ciklusa za Golden Gate oscilira između 37 °C i 16 °C jer je 37 °C optimalno za restrikcijske enzime, a 16 °C optimalno za ligaze.
Šta je Gibson Assembly?
Gibson Assembly je metoda molekularnog kloniranja koja omogućava sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Za razliku od metode Golden Gate, ova metoda se ne oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koja se klonira. Pronašao ga je Daniel G. Gibson sa Instituta J. Craig Venter. Ova tehnika je vrsta metode kloniranja nezavisnog od sekvence i ligaze (SLIC).
Slika 02: Gibsonov sklop
Gibsonova montažna procedura
Gibsonovom sklopu su potrebni DNK fragmenti koji sadrže 20-40 parova baza koji se preklapaju sa susjednim DNK fragmentima. Preklapanja se dodaju putem PCR-a. Zatim se ovi fragmenti DNK dodaju u Gibsonovu maser mješavinu koja ima tri enzima. Ovaj postupak se izvodi u izotermnim uslovima (50 °C tokom 1 sata) koristeći tri različita enzima: egzonukleaza, DNK polimeraza i DNK ligaza. Egzonukleaza žvače DNK sa 5’ kraja. Dakle, ne inhibira aktivnost polimeraze i dopušta da se reakcija odvija u jednom procesu. Rezultirajuće jednolančane regije na susjednim DNK fragmentima mogu se žariti zbog preklapanja sekvenci. DNK polimeraza popunjava praznine dodavanjem nukleotida. Konačno, DNK ligaza se kovalentno spaja sa DNK susjednih segmenata. Obično Gibson Assembly koristi linearizirane odredišne vektore. Štaviše, ova metoda može istovremeno kombinovati do 15 fragmenata DNK na osnovu sličnosti sekvence.
Sličnosti između Golden Gatea i Gibson Assembly
- Golden Gate i Gibson Assembly su dvije metode molekularnog kloniranja.
- Obje metode mogu sastaviti više fragmenata DNK u jedan komad.
- Ove metode koriste odredišne vektore.
- Obje metode koriste termalne cikluse za sklapanje višestrukih DNK fragmenata.
- Koriste se u mutagenezi usmjerenoj na mjesto.
Razlika između Golden Gatea i Gibson Assembly
Golden Gate je metoda molekularnog kloniranja koja se koristi u sastavljanju višestrukih fragmenata DNK u jedan komad koji se oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati, dok je Gibson Assembly metoda molekularnog kloniranja koja se koristi u sastavljanje višestrukih fragmenata DNK u jedan komad bez oslanjanja na prisutnost restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koju treba klonirati. Ovo je ključna razlika između Golden Gate-a i Gibson Assembly-a. Nadalje, Golden Gate metoda koristi kružni vektor odredišta, dok Gibson Assembly metoda koristi linearizirani vektor odredišta.
Sljedeća infografika prikazuje razliku između Golden Gatea i Gibson Assembly.
Sažetak – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekularno kloniranje je metoda koja se koristi za sastavljanje rekombinantnih molekula DNK i usmjeravanje njihove replikacije unutar organizama domaćina. Golden Gate i Gibson Assembly su dvije metode molekularnog kloniranja koje omogućavaju sastavljanje više fragmenata DNK u jedan komad. Golden Gate metoda se oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koja se klonira, dok se Gibson Assembly ne oslanja na prisustvo restrikcijskih mjesta unutar određene sekvence koja se klonira. Dakle, ovo je ključna razlika između Golden Gatea i Gibson Assembly.
