Ključna razlika – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green i Taqman su dvije metode koje se koriste za otkrivanje ili praćenje procesa amplifikacije PCR-a u realnom vremenu. SYBR Green je metoda bazirana na interkalirajućoj boji za bojenje nukleinskom kiselinom, dok je Taqman metoda bazirana na sondi za hidrolizu. Obe tehnologije su dizajnirane da generišu fluorescenciju tokom PCR-a, što omogućava PCR mašini u realnom vremenu da prati reakciju u „realnom vremenu“. SYBR Green metoda se provodi korištenjem fluorescentne boje zvane SYBR green i detektuje pojačanje vezivanjem boje za proizvedenu dvolančanu DNK. Taqman se provodi korištenjem dvostruko označenih sondi i detektuje pojačanje degradacijom sonde Taq polimerazom i oslobađanjem fluorofora. Ovo je ključna razlika između SYBR Green i Taqman.
Šta je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescentna boja koja se koristi za bojenje nukleinskih kiselina, posebno dvolančane DNK u molekularnoj biologiji. SYBR Green metoda se koristi za kvantifikaciju PCR proizvoda tokom PCR-a u realnom vremenu. Jednom kada se veže s DNK, rezultirajući kompleks DNK-boje apsorbira plavo svjetlo i emituje intenzivnu zelenu svjetlost. To se događa zbog strukturne promjene koja se javlja u molekuli boje nakon vezivanja s dvolančanom DNK. Kada PCR stvara sve više i više DNK, više molekula boje se veže za DNK, stvarajući više fluorescencije. Stoga se fluorescencija povećava sa akumulacijom PCR proizvoda. Stoga se količina PCR proizvoda može kvantitativno izmjeriti detekcijom SYBR Green fluorescencije.
SYBR zelena boja se takođe može koristiti za obeležavanje DNK u citometriji i fluorescentnoj mikroskopiji. Etidijev bromid je uspješno zamijenjen SYBR Green pošto je etidijev bromid kancerogena boja s problemima odlaganja tokom vizualizacije DNK u gel elektroforezi.
Postoje prednosti i nedostaci SYBR zelene metode. Ova metoda je vrlo osjetljiva, jeftina i jednostavna za korištenje. Međutim, zbog svoje sposobnosti da se veže za bilo koju dvolančanu DNK, nespecifično vezivanje može dovesti do prevelike kvantifikacije PCR proizvoda.
Slika 01: SYBR zelena tehnika
Šta je Taqman?
Taqman je alternativni metod za SYBR Green za praćenje PCR procesa u realnom vremenu. Ova metoda ovisi o 5’ – 3’ egzonukleaznoj aktivnosti enzima Taq polimeraze kako bi se razgradile sonde tokom produžetka novog lanca i oslobađanja fluorofora. Dvostruko označene sonde se koriste u ovoj metodi i zasniva se na hidrolizi sondi. Sonde su fluorescentno obilježeni DNK oligonukleotidi koji imaju fluorescentni reporterski molekul (fluorofor) na 5’ kraju i molekul za gašenje na 3’ kraju. Dizajnirani su tako da se vežu za jednolančanu šablonu na suprotnoj strani žarenja prajmera. Taq polimeraza dodaje nukleotide prajmeru i proširuje novi lanac prema dvostruko označenim sondama. Kada se Taq polimeraza sretne sa sondom, djelovanje egzonukleaze Taq polimeraze aktivira i degradira sondu. Nakon što završi sintezu novog lanca, sonda se podvrgava potpunoj degradaciji i oslobađanju fluorofora. Oslobađanje fluorofora stvara fluorescenciju. Fluorescent Quencher molekul efikasno gasi emitovano svetlo i stvara izlaz za kvantifikaciju PCR proizvoda. Oslobađanje fluorofora i količina PCR proizvoda su proporcionalni. Dakle, kvantifikacija se može lako izvršiti Taqman metodom.
Slika 02: Taqman metoda
Taqman metoda se koristi u PCR-u u realnom vremenu, kvantifikaciji genske ekspresije, detekciji genetskih polimorfizama, kvantificiranju brisanja hromozomske DNK, identifikaciji bakterija, verifikaciji analize mikromreža, SNP genotipizaciji itd.
Koja je razlika između SYBR zelene i Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Zelena je bazirana na boji koja veže DNK. | Taqman ovisi o hibridizacijskim sondama i 5’ do 3’ egzonukleaznoj aktivnosti Taq polimeraze. |
| Fluorescentno označene sonde | |
| Nisu potrebne fluorescentno označene sonde. | Potrebne su sonde sa dvostrukom oznakom. |
| Multipleksna analiza gena | |
| Ne može se koristiti za multipleks genske mete. | Može se koristiti za multipleks genske mete. |
| Cena | |
| Ovo je jeftinije. | Ovo je skuplje. |
| Specifičnost | |
| Ovo je manje specifično i vezuje se za bilo koju dvolančanu DNK | Ove su vrlo specifične jer sonde otkrivaju specifične proizvode pojačanja. |
| Efektivnost | |
| Ovo je manje efikasno. | Ovo je veoma efikasno. |
| Prijava | |
| Ovo se koristi u PCR-u u realnom vremenu, vizualizaciji agaroznog gela, označavanju DNK itd. | Ovo se koristi u realnom vremenu PCR, kvantifikacija ekspresije gena, detekcija genetskih polimorfizama, itd. |
Sažetak – SYBR Green i Taqman
Taqman i SYBR green su dvije metode koje se koriste u PCR-u u realnom vremenu (kvantitativni PCR). Obe metode omogućavaju efikasnu kvantifikaciju PCR proizvoda i oslanjaju se na emisiju fluorescencije. Taqman metoda koristi sonde sa dvostrukom oznakom za detekciju akumulirane DNK, dok SYBR Green metoda koristi fluorescentnu boju. Obje ove metode također imaju različite primjene u molekularnoj biologiji.
