Ključna razlika – Topla vs Hladna tripsinizacija
Topla i hladna tripsinizacija su dvije metode koje se koriste u enzimskoj dezagregaciji ćelija u uzgoju životinjskih ćelija. Ključna razlika između tople i hladne tripsinizacije, kao što nazivi sugeriraju, ovisi o temperaturi na kojoj se tripsin dodaje za staničnu dezagregaciju. Topla tripsinizacija se odvija u uslovima viših temperatura (36,5 – 37 0C), dok se hladna tripsinizacija odvija u uslovima niskih temperatura.
Tokom procesa primarnog uzgoja ćelija životinjskih ćelija, koriste se tri glavne metode koje su se pokazale uspješnim. Tri metode uključuju mehaničku dezagregaciju ćelija, enzimsku dezagregaciju ćelija i tehniku primarne eksplantacije. Enzimska dezagregacija ćelija dovodi do izolacije ćelija, a vrši ga enzim tripsin koji razgrađuje proteine. Stoga je ovaj proces poznat kao tripsinizacija. Tripsinizacija se može obaviti pod dva različita uslova, odnosno toplom tripsinizacijom i hladnom tripsinizacijom. Topla tripsinizacija je metoda tretiranja ćelija tripsinom u toplim uslovima na temperaturi od 36,5 – 37 0C. Hladna tripsinizacija je proces tretmana tripsinom koji se odvija u hladnijim uvjetima, po mogućnosti u ledu uz održavanje vrlo niske temperature.
Šta je topla tripsinizacija?
Tripsinizacija se može uraditi kako bi se dezagregirale ćelijske komponente kako bi se izolovale ćelije za proizvodnju primarne ćelijske kulture. Tripsin je enzim za razgradnju proteina, a mješavina enzima koja se koristi u tripsinizaciji može biti ili sirovi ekstrakt ili pročišćeni proizvod. Za sirovi ekstrakt se kaže da je efikasniji u lizi proteina i dezintegraciji ćelija jer sadrži druge degradativne enzime.
Topla tripsinizacija je najčešće korišćena enzimska metoda za dezagregaciju ćelija koja se odvija u uslovima viših temperatura. Prije tretmana tripsinizacijom, željeno tkivo se isjecka na manje komade. Olakšava lak proces raščlanjivanja. Usitnjeno tkivo se zatim ispere u posebnom mediju poznatom kao medij bazalne soli za disekciju.
Po završetku koraka ispiranja, ćelije se transformišu u bocu koja sadrži aktivni enzim, a to je tripsin. Kako ova tehnika podrazumijeva topli protokol tripsinizacije, tripsin se stavlja na temperaturu od oko 37 0C oko četiri sata.
Slika 01: Trypsin
Sadržaj se miješa i miješa korištenjem metoda centrifugiranja radi lakšeg protokola i ubrzavanja procesa razdvajanja. Kada se postigne preporučeno vrijeme, ćelije se mogu izvući iz supernatanta. Ćelije izvedene iz supernatanta se zatim inkubiraju na određenoj temperaturi i vremenu.
Šta je hladna tripsinizacija?
Hladna tripsinizacija je druga vrsta tripsinizacije koja se odvija u hladnim uslovima. U ovoj tehnici, stanice koje su usitnjene i isprane stavljaju se u bočice na led i zatim natopljene tripsinom. Period namakanja je mnogo duži – oko 6 – 24 sata.
Nakon završetka postupka namakanja, tripsin se uklanja iz ćelijskog lizata, a komadi tkiva se dalje inkubiraju na 37 0C oko 20 – 30 minuta. Dezagregacija ćelija se postiže ponovljenim pipetiranjem mešavine tkiva. Ovo će omogućiti ćelijama da se odvoje od membrane i dođu do supernatanta. Kada se ćelije nađu u supernatantu, inkubiraju se i uzgajaju na željenoj temperaturi i vremenskom periodu.
Metoda hladne tripsinizacije ima nekoliko prednosti
- Veći prinos živih ćelija jer je oštećenje ćelija svedeno na minimum. Šteta ćelije je svedena na minimum ako se ne koriste koraci centrifugiranja.
- Veoma praktičan metod.
- Manje naporno.
Glavno ograničenje metode hladne tripsinizacije je da se velike količine ne mogu koristiti u jednom slučaju.
Koje su sličnosti između tople i hladne tripsinizacije?
- Procesi tople i hladne tripsinizacije koriste enzim tripsin za dezagregaciju ćelija.
- Postupci tople i hladne tripsinizacije koriste se u postupcima kulture ćelija za razdvajanje ćelija.
- U postupcima tretmana toplom i hladnom tripsinizacijom, ćelije su izvedene iz supernatanta.
Koja je razlika između tople i hladne tripsinizacije?
Topla vs hladna tripsinizacija |
|
| Topla tripsinizacija je metoda tretiranja ćelija tripsinom u toplim uslovima na temperaturi od 36,5 – 37 0. | Hladna tripsinizacija je proces tretmana tripsinom koji se odvija u hladnijim uslovima, poželjno u ledu uz održavanje veoma niske temperature. |
| Protokol | |
| Sjeckani komadići tkiva održavaju se na 37 0C kontinuirano tokom postupka. | Sjeckani komadići tkiva se u početku održavaju na ledeno hladnoj temperaturi, a zatim se održavaju na 37 0. |
| Temperatura | |
| Topla tripsinizacija se dešava na 36,5 – 37 0 | Hladna tripsinizacija se dešava na ledeno hladnim temperaturama. |
| Potrošeno vrijeme | |
| Manje vremena potrebno za cijeli proces (oko 4 sata) tople tripsinizacije. | Potrebno je duže vrijeme (oko 6 – 24 sata) za hladnu tripsinizaciju. |
| Prinos održivih ćelija | |
| Malo tople tripsinizacije. | Visoka hladna tripsinizacija. |
| Upotreba centrifugiranja | |
| Centrifugiranje je potrebno za dezagregaciju ćelija u toploj tripsinizaciji. | Centrifugiranje nije potrebno u hladnoj tripsinizaciji. |
| Početna količina tkiva za tripsinizaciju | |
| Veća količina tkiva može se koristiti za toplu tripsinizaciju. | Manja količina tkiva može se koristiti u hladnoj tripsinizaciji. |
| Oštećenje ćelije | |
| Visoka zbog centrifugiranja u toploj tripsinizaciji. | Manje zbog hladne tripsinizacije. |
Sažetak – Topla vs hladna tripsinizacija
Tripsinizacija je metoda upotrebe enzima tripsina koji razgrađuje proteine za dezagregaciju i pripremu primarnih ćelijskih kultura tokom procesa kultivacije ćelija. Postoje dvije glavne tehnike tripsinizacije na osnovu temperatura koje se koriste tokom postupka. Oni su topla i hladna tripsinizacija. Topla tripsinizacija se izvodi na 37 0C dok se hladna tripsinizacija izvodi u ledeno hladnim uslovima. Iako je za hladnu tripsinizaciju potrebno duže vrijeme za završetak, kaže se da ima veći prinos živih ćelija. To je zbog činjenice da je oštećenje stanica minimalizirano hladnom tripsinizacijom jer se ne koriste snažni koraci centrifugiranja. Ovo je razlika između tople i hladne tripsinizacije.
