Ključna razlika – PCR vs DNK sekvenciranje
PCR i DNK sekvenciranje su dvije važne tehnike u molekularnoj biologiji. Lančana reakcija polimerazom (PCR) je proces kojim se stvara veliki broj kopija fragmenta DNK. Sekvenciranje DNK je tehnika koja rezultira preciznim redoslijedom nukleotida datog fragmenta DNK. Ovo je ključna razlika između PCR i DNK sekvenciranja. PCR je jedan od glavnih koraka uključenih u sekvenciranje DNK.
Šta je PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) je tehnika amplifikacije DNK koja se koristi u molekularnoj biologiji. Ona proizvodi hiljade do milione kopija određenog fragmenta DNK. Ovu metodu je razvio Kary Mullis 1983. U ovoj tehnici, fragment DNK koji se amplificira služi kao šablon, a enzim DNK polimeraza dodaje komplementarne nukleotide prajmeru koji je dostupan u PCR mješavini. Na kraju PCR reakcije sintetiziraju se mnoge kopije DNK uzorka.
Postoje različite komponente PCR mješavine, uključujući DNK, DNK polimerazu (Taq polimerazu), prajmere (prednji i reverzni prajmeri), nukleotide (građevinske blokove DNK) i pufer. PCR se odvija unutar PCR mašine, a ispravna PCR mešavina treba da se učita u mašinu i da se pokrene ispravan program. Ova tehnika omogućava proizvodnju hiljada do miliona kopija određenog dijela DNK iz vrlo male količine DNK.
PCR reakcije se odvijaju na cikličan način kako bi se proizvela vidljiva količina PCR proizvoda na gelu. Postoje tri glavna koraka uključena u PCR reakciju, a to su denaturacija, žarenje prajmera i produžavanje niti kao što je prikazano na slici 01. Ova tri koraka se odvijaju na tri različite temperature. DNK postoji u dvolančanom obliku pomoću vodoničnih veza između komplementarnih baza. Prije implikacije, dvolančanu DNK treba odvojiti jedan od drugog. Radi se davanjem visoke temperature. Na visokoj temperaturi, dvolančana DNK denaturira u jednostruke lance. Tada bi se prajmeri trebali približiti bočnim krajevima specifičnog fragmenta ili gena DNK. Prajmer je kratak komad jednolančane DNK koji je komplementaran ciljnoj sekvenci. Prednji i reverzni prajmeri se žare s komplementarnim bazama na bočnim krajevima denaturiranog uzorka DNK na temperaturi žarenja. Prajmeri treba da budu otporni na toplotu. Jednom kada se prajmeri spoje sa uzorkom DNK, enzim taq polimeraza inicira sintezu novih lanaca dodavanjem nukleotida koji su komplementarni ciljnoj DNK. Taq polimeraza je toplotno stabilan enzim izolovan iz termofilne bakterije zvane Thermus aquaticus. PCR pufer održava optimalne uslove za djelovanje taq polimeraze. Ove tri faze PCR reakcija se ponavljaju kako bi se proizvela potrebna količina PCR proizvoda. Nakon svake PCR reakcije, broj kopije DNK se udvostručuje. Stoga se u PCR-u može uočiti eksponencijalna amplifikacija. PCR proizvodi se mogu posmatrati korišćenjem gel elektroforeze i mogu se pročistiti za dalje studije.
Slika 01: Glavni koraci PCR reakcije
PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. PCR ima posebnu vrijednost u forenzičkoj nauci jer može pojačati DNK za studije iz sićušnih uzoraka od kriminalaca i napraviti forenzičke DNK profile. PCR se široko koristi u mnogim područjima molekularne biologije, uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, detekciju mutacija, sekvenciranje DNK, mikronizove DNK i testiranje očinstva, itd.
Slika 02: Lančana reakcija polimerazom
Šta je sekvenciranje DNK?
DNK sekvenciranje je određivanje preciznog reda nukleotida – adenin, gvanin, citozin i timin u datom fragmentu DNK. Genetske informacije se pohranjuju u sekvencama DNK koristeći ispravan redoslijed nukleotida. Stoga je pronalaženje preciznog reda nukleotida u fragmentu DNK veoma važno znati o strukturi i funkciji gena.
Protokol sekvenciranja DNK uključuje različite procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNK ili genomske DNK organizma. Koristeći PCR (kao što je gore opisano), željeni region DNK treba da se amplificira. Amplificirani PCR proizvod treba odvojiti gel elektroforezom i pročistiti. Amplificirani fragmenti služe kao šabloni za sekvenciranje. Sekvenciranje se može obaviti ili slijedeći Sanger sekvenciranje ili metodu sekvenciranja visoke propusnosti. Sanger sekvencioniranje zahtijeva kapilarnu elektroforezu rezultirajućih fragmenata DNK. Određivanje ispravnog reda nukleotida može se obaviti ručnim čitanjem autoradiografa ili korištenjem automatiziranih DNK sekvencera.
Sekvenciranje gena je doprinijelo projektu Ljudski genom i olakšalo mapiranje ljudskog genoma 2003. U forenzici, sekvenciranje DNK je omogućilo identifikaciju pojedinaca koji pokazuju jedinstvene sekvence DNK i identifikuju kriminalce. U medicini se sekvenciranje DNK može koristiti za otkrivanje gena odgovornih za genetske i druge bolesti, pronalaženje defektnih gena i njihovo zamjenu ispravnim genima. U poljoprivredi se informacije o sekvenciranju DNK nekih mikroorganizama koriste za proizvodnju transgenih usjeva sa ekonomski željenim karakteristikama.
Slika 03: DNK sekvenciranje
Koja je razlika između PCR-a i DNK sekvenciranja?
PCR vs DNK sekvenciranje |
|
| PCR proces stvara hiljade do milione kopija zainteresovanog DNK fragmenta. | DNK sekvenciranje je proces određivanja preciznog reda nukleotida u datom fragmentu DNK. |
| Ishod | |
| PCR stvara hiljade do milione kopija određenog fragmenta DNK | Ovo rezultira ispravnim redoslijedom baza u određenom fragmentu DNK. |
| Učešće ddNTP-a | |
| PCR ne zahtijeva ddNTP. Koristi dNTPs. | DNK sekvenciranje zahtijeva ddNTPs da prekine formiranje lanaca. |
Sažetak – PCR vs DNK sekvenciranje
PCR i DNK sekvenciranje su veoma važni alati u mnogim oblastima molekularne biologije. Amplifikacija fragmenata DNK se vrši PCR tehnikom dok se tačan redosled nukleotida fragmenta DNK određuje sekvenciranjem DNK. Ovo je razlika između PCR i DNK sekvenciranja.
